适合工业化制备茶叶儿茶素EGCG的方法及提高EGCG生物利用度的研究

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表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)是绿茶儿茶素中的一种主要活性成分,在食品,医药等领域都有广泛的应用前景,然而目前尚未有很好的简便、快速、低成本、环境友好的制备高纯度EGCG的方法。此外,EGCG较低的贮藏稳定性和胃肠道稳定性也限制其在生产中的应用。因此,本文研究并优化了国产大孔树脂纯化茶多酚中EGCG单体的工艺,并以脂质体、类脂质体和胆盐脂质体为载体包埋EGCG后对其储藏稳定性、胃肠道稳定性和生物利用度进行评价,最后通过小鼠结肠炎模型探究胆盐脂质体包埋前后EGCG功能活性的变化。主要研究内容与结果如下:通过静态吸附/解吸实验筛选出具有高吸附量和解吸率的NKHC-2树脂和LX-20B树脂,通过动态乙醇梯度洗脱实验进一步筛选出对EGCG分离效果较好的LX-20B树脂用以研究EGCG的纯化工艺。动态吸附/洗脱优化实验确定最佳工艺条件为:0.2 BV 250mg/m L茶多酚溶液以1 BV/h的流速上样后,先用2 BV去离子水洗脱得组分W,再用1 BV 30%(v/v)乙醇洗脱得组分E30-1,继续用1 BV 30%(v/v)乙醇洗脱得组分E30-2,最后用3 BV 80%(v/v)乙醇洗脱得组分E80。其中,组分E30-2中EGCG纯度可达70.08±2.55%,EGCG回收率可达68.07±2.43%。树脂重复使用6次之后,分离效率无显著变化。组分E30-2在40%(w/w)的水溶液中结晶7 d之后,EGCG纯度可达95.87±0.89%。通过紫外光谱、质谱、红外光谱、~1H核磁共振谱图确定了纯化所得物质为EGCG,通过X射线衍射确定本文中纯化所得EGCG的晶型结构为I型,并通过扫描电镜观察EGCG结晶形态为细长型碎片结构。以EGCG包埋率、粒径、多分散指数(Polydispersity index,PDI)、Zeta电位值为指标,制备了一种含有胆盐的EGCG脂质体,称为EGCG胆盐脂质体。其最佳工艺条件如下:胆固醇:Tween40为1:4(w/w)、胆酸钠:Tween40为1:8(w/w)、EGCG添加量为50 mg时,在该条件下EGCG包埋率为85.93±1.43%、粒径为189.2±12.7 nm、PDI为0.234±0.012、Zeta电位为-39.2±1.8 m V。以EGCG保留率、粒径和Zeta电位值为指标,测定EGCG包埋体系的储藏稳定性和模拟胃肠道稳定性。在p H 6环境中储藏至第8周时,类脂质体和胆盐脂质体中EGCG保留率分别为游离EGCG的1.19倍和1.20倍。在Na Cl溶液(0、20、50、100 mmol/L)中储存至第8周时,类脂质体中EGCG保留率分别为游离EGCG的1.08、1.08、1.09、1.21倍,而胆盐脂质体中游离EGCG保留率分别为游离EGCG的1.07、1.05、1.10、1.22倍。在25℃和37℃下储存至第8周时,类脂质体中EGCG保留率分别为游离EGCG的1.08和4.94倍,而胆盐脂质体中EGCG保留率分别为游离EGCG的1.07和4.33倍。这些结果表明类脂质体和胆盐脂质体能够提高EGCG在p H 6、不同浓度Na Cl溶液(0~100mmol/L)和不同温度(25℃和37℃)下的稳定性。模拟消化实验结果显示游离EGCG、EGCG脂质体、类脂质体和胆盐脂质体经过胃肠道模拟消化后EGCG保留率分别为3.09±0.41%、24.02±3.93%、55.74±6.85%和71.67±4.05%,表明EGCG胆盐脂质体的胃肠道稳定性最高。选择胃肠道稳定性最高的EGCG胆盐脂质体,通过大鼠实验进行EGCG药代动力学的研究,结果显示胆盐脂质体的包埋可以延缓EGCG在体内的释放,且能够将EGCG的药代动力学曲线下面积提高约1.98倍。通过葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium,DSS)建立小鼠结肠炎模型并探究EGCG和EGCG胆盐脂质体对小鼠结肠炎的影响。在20 mg/kg/d的剂量下,相比EGCG,EGCG胆盐脂质体能够更显著地减少小鼠体重损失、疾病活动指数(Disease activity index,DAI)和组织损伤评分,恢复结肠长度。通过氧化应激和炎症因子指标的测定探究EGCG缓解结肠炎的作用机制,结果显示,EGCG能够通过恢复小鼠结肠和血清中的谷胱甘肽(Glutathione,GSH)和超氧化物歧化酶水平(Superoxide dismutase,SOD),降低结肠中的髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)活性,下调小鼠结肠组织和血清中的肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)的水平,上调小鼠结肠组织中白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)的水平以改善小鼠结肠炎症,相比EGCG,EGCG胆盐脂质体在提高小鼠血清中SOD水平,降低小鼠血清中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量和小鼠结肠中MPO活性,下调小鼠血清中的TNF-α和IL-6的水平上显著优于EGCG,从而更好地缓解小鼠结肠炎症状。
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