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氧化应激引起的卵巢颗粒细胞(GCs)死亡是哺乳动物卵泡闭锁的重要原因,越来越多的研究表明颗粒细胞氧化损伤可能与自噬有关。据报道,c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal protein kinase,JNK)的激活可以促进自噬关键蛋白BECN1的表达,同时抑制BCL-2与BECN1的结合,进而诱导细胞自噬。褪黑素(Melatonin,MT)是卵泡内含量较多的抗氧化活性物质,研究显示MT能有效抑制氧化应激引起的颗粒细胞死亡,但具体机制尚未完全阐明。另外,有文献证实,MT对JNK及细胞自噬均存在抑制作用,因此我们猜想MT可能通过影响JNK依赖的细胞自噬应答参与对颗粒细胞抗氧化损伤过程的调控。为证明该设想,本文主要开展以下方面研究内容:(1)通过检测细胞活力和JNK活性探明MT抑制颗粒细胞氧化损伤和JNK活性间的关系;(2)通过免疫印迹检测自噬相关蛋白的表达、荧光显微镜观察转染GFP-MAP1LC3B质粒的细胞中自噬斑点的累积情况,明确氧化应激条件下MT对颗粒细胞自噬的调节作用;(3)氧化应激及MT处理条件下阻断细胞自噬后,通过检测细胞活力水平,阐明MT的抗氧化损伤作用与细胞自噬的关系;(4)氧化应激条件下,通过测定MT处理后JNK通路下游BCL-2和BECN1的表达和互作,进一步探明MT-JNK途径调控颗粒细胞自噬性死亡的分子机制。研究结果如下:1.褪黑素通过抑制JNK信号通路抵抗小鼠卵泡颗粒细胞的氧化损伤利用H202处理体外培养的小鼠卵泡颗粒细胞,构建了颗粒细胞的体外氧化应激模型。结果显示,褪黑素预处理可以抑制H202诱导的GC活力降低,促进细胞存活。同时,褪黑素也能阻断氧化应激介导的JNK激活。氧化应激下,在褪黑素预处理基础上添加JNK抑制剂(SP600125)不会进一步恢复细胞活力,提示JNK途径可能参与了褪黑素抑制颗粒细胞氧化损伤的作用。2.褪黑素对JNK活性的抑制阻断了氧化应激引起的颗粒细胞自噬性死亡Western Blot结果显示褪黑素可以显著抑制H2O2介导的MAP1LC3B-Ⅰ向MAP1LC3B-Ⅱ的转化以及SQSTM1的降解。另外通过转染GFP-MAP1LC3B质粒发现,褪黑素处理后,氧化应激引起的自噬斑点积聚现象显著降低,而且氧化应激条件下在MT处理基础上添加SP600125,无法进一步降低自噬水平。为了证明该过程中自噬对细胞活力的影响,我们在GCs中添加了自噬抑制剂3-MA。结果显示氧化应激条件下,阻断自噬和/或JNK,MT处理均能显著抑制细胞死亡。而MT处理后无论阻断自噬和/或JNK对细胞活力均无显著影响。特别是在MT与JNK抑制剂共处理基础上添加3-MA无法进一步恢复细胞活力。上述结果共同说明褪黑素可通过阻断JNK途径抑制氧化应激引起的颗粒细胞自噬性死亡。3.BECN1参与了褪黑素抑制小鼠颗粒细胞自噬的调控(1)褪黑素抑制了 JNK介导的自噬过程中的BECN1表达BECN1作为一个自噬关键蛋白,其表达变化反映了自噬水平的变化。通过检测JNK下游调控因子BCL-2和BECN1的表达发现,氧化应激下颗粒细胞中的BECN1无论在mRNA水平还是蛋白水平均显著升高,而在MT或SP600125预处理后基因表达明显下降。且氧化应激条件下,在褪黑素处理基础上添加SP600125不会进一步下调BECN1基因的表达,提示JNK途径可能参与褪黑素诱导的BECN1表达下调。而BCL-2的表达无论在mRNA还是蛋白水平均无明显变化。综上所述,褪黑素-JNK途径可能通过BECN1依赖方式调节小鼠卵泡颗粒细胞中的自噬水平。(2)褪黑素介导的JNK活性抑制促进BCL-2/BECN1复合物的形成通过免疫共沉淀实验发现,MT、JNK抑制剂均能显著抑制氧化应激引起的BCL-2与BECN1的解离,但在MT处理基础上阻断JNK通路,无法进一步恢复BCL-2与BECN1的结合能力。该结果说明氧化应激下,MT通过抑制BCL-2/BECN1复合物的解离从而抑制JNK介导的自噬。4.褪黑素直接通过抑制自噬而非其ROS清除作用来保护颗粒细胞存活通过靶向抑制MT下游抗氧化物的结果显示,在抑制其抗氧化酶的情况下,MT仍能抑制氧化应激介导的自噬激活,恢复颗粒细胞活力,说明MT可不通过其抗氧化作用而是直接通过特异性抑制自噬来实现氧化应激下对颗粒细胞的保护作用。综上,本文提出了一种MT保护颗粒细胞氧化损伤的新模型,即MT可通过阻断氧化应激对JNK途径的激活从而抑制颗粒细胞的自噬性死亡。研究结果提示氧化应激下可以通过阻断JNK通路减轻颗粒细胞氧化损伤,为治疗排卵障碍相关疾病提供理论依据。