论文部分内容阅读
研究目的:
神经甾体是一类类固醇激素,它通过与配体门控离子通道如GABA-A受体相互作用改变神经元兴奋性.研究发现,两种神经甾体,3α,5α-别孕烷醇酮(Allopregnanolone,ALLO)和3α,5α-雄甾烷二醇(3α,5α-androstanediol,DIOL)是有效的GABA-A受体激动剂.5α-还原酶1型(5α-reductasetype1,SRD5A1)、3α-羟基类固醇脱氢酶(3α-hydroxysteroiddehydrogenase,AKR1C14)和视黄醇脱氢酶2(Retinoldehydrogenase2,RDH2)参与其合成和代谢.在合成方面,SRD5A1和AKR1C14这两种类固醇生成酶是神经甾体合成的关键酶.SRD5A1位于脑细胞的光滑内质网中,其催化需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamideadeninedinucleotidephosphate,NADPH)作为辅助因子.SRD5A1将孕烯醇酮(Pregnenolone,P5)或睾酮(Testosterone,T)催化生成5α-二氢孕烯醇酮(5α-dihydropregnenolone,DHP)或5α-二氢睾酮(5α-dihydrotestosterone,DHT).AKR1C14属于醛酮还原酶家族,并在许多类固醇的3-位置加氢发挥还原作用.AKR1C14位于脑细胞的细胞质中,其催化需要NADPH作为辅助因子.AKR1C14分别将DHP和DHT催化成ALLO或DIOL.在代谢方面,RDH2是参与大鼠神经甾体代谢的关键酶.RDH2属于短链脱氢酶/还原酶家族,并从许多类固醇的3-位置除去氢.RDH2位于脑细胞的光滑内质网中,其催化需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamideadeninedinucleotide,NAD+)作为辅助因子.RDH2将ALLO和DIOL催化回DHP和DHT.
多溴联苯醚(Polybrominateddiphenylethers,PBDEs)是一类连接有1-10个溴原子的溴化烃.PBDEs通过光降解代谢成4-单溴联苯醚(4-monobromodiphenylether,BDE-3).PBDEs作为一种阻燃剂,被广泛应用在许多工业和消费品中.由于这些PBDEs化合物具有高度稳定性和持久性,因此PBDEs无处不在并造成严重而持久的环境污染.然而,它们对神经系统的潜在影响尚不清楚.本研究中,我们采用COS-1细胞培养和瞬时转染技术对SRD5A1、AKR1C14和RDH2的活性进行测定并采用酶动力学分析.在众多PBDEs中,我们选定了其中4种主要化合物作为参考,包括BDE-3、2,2,4,4-四溴联苯醚(Tetrabromodiphenylether,BDE-47)、2,2,4,4,6-五溴联苯醚(Pentabromodiphenylether,BDE-100)和2,2,4,4,6,6-六溴联苯醚(Hexabromodiphenylether,BDE-153).我们在转染的COS-1细胞中,比较了上述4种PBDEs和结构相似的4-溴联苯(4-bromobiphenyl,BBP)附着在1到6个溴原子的效力,来分析在转染的COS-1细胞中,4种不同的PBDEs抑制大鼠SRD5A1、AKR1C14和RDH2活性的效力,来观察PBDEs对大鼠神经甾体生物合成和代谢的影响及其机制.
研究方法:
将COS-1细胞等分铺在六孔板中,使每孔含有1.0×106个COS-1细胞,于37℃温度下进行过夜贴壁培养.COS-1细胞在含有炭剥离的胎牛血清的培养基中维持24h,细胞密度达到50-80%覆盖,进行细胞转染.每孔中加入1μgDNA以获得最大转染效率.24小时后,用0.01mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤转染的COS-1细胞,并在胰蛋白酶消化后收获并在补充有0.25M蔗糖的0.01mMPBS中匀浆.选择750×g离心10分钟以除去细胞核和大细胞碎片.将上清液转移至超速离心管中并以105,000×g离心两次以收集微粒体沉淀(用于SRD5A1和RDH2测定)和细胞质基质部分(用于AKR1C14测定).测定蛋白质浓度并最终稀释为20mg/ml,分别配成反应液.通过检测各底物生成物的放射峰值并计算底物到产物的转化百分比对SRD5A1、AKR1C14、RDH2的活性进行测定.采用酶动力学分析每种BDE在转染的COS-1细胞中对SRD5A1、AKR1C14和RDH2酶转化活性的抑制效力.
研究结果:
SRD5A1、AKR1C14和RDH2在辅因子和底物存在下的酶活性反应呈时间依赖性.SRD5A1、AKR1C14和RDH2反应在45-60分钟内显示出线性.
PBDEs对SRD5A1活性的影响显示SRD5A1的表观Km为2.852±0.149μM,表观Vmax为1.283pmol±0.208pmol/min.mg.在100μM时,上述化学物质也显著抑制SRD5A1活性,BDE-100和BDE-153的抑制率超过50%,BDE-3和BDE-47的抑制率约为50%,而BBP低于50%.这表明同其他化学物质相比,BDE-100和BDE153有显著的抑制作用.进一步的抑制剂-反应分析结果显示BDE-100和BDE-153的IC50值分别为0.367±0.078μM和0.876±0.066μM.当底物为睾酮时,BDE-100和BDE-153都是SRD5A1竞争性抑制剂.
AKR1C14的表观Km为2.981±0.270μM,表观Vmax为66.13pmol±2.260pmol/min.mg.在100μM的浓度下,只有BDE-100显著抑制AKR1C14活性.进一步对BDE-100进行抑制剂-反应分析,显示BDE-100的IC50值为5.665±0.055μM.
RDH2的表观Km为2.760±0.0336μM,表观Vmax为539.5pmol±2.427pmol/min.mg.在100μM,在所有测试的化学物中,没有一种显示出对RDH2活性的显著抑制.
研究结论:
BDE-3、BDE-47、BDE-100和BDE-153都是SRD5A1的特异性抑制剂,抑制大鼠SRD5A1的效力依次为BDE-100＞BDE-153＞BDE-47≥BDE-3＞BBP.且相对于SRD5A1,BDE-100、BDE-153、BDE47、BDE-3和BBP的半数抑制浓度(IC50)值分别为0.367、0.876、＞100、＞制剂,它可能通过与SRD5A1和AKR1C14与NADPH结合的相关位点结合从而导致脑内神经甾体合成受阻.
RDH2不是PBDEs的作用靶点.RDH2与SRD5A1和AKR1C14不同,因为它的辅助因子是NAD+,而SRD5A1和AKR1C14的辅助因子为NADPH.由于一些PBDEs通过与酶的辅助因子NADPH结合位点竞争来抑制SRD5A1和AKR1C14,所以PBDEs介导的抑制可能是通过NAD+和NADPH化学结构的差异进行调节.这表明PBDEs主要针对神经甾体合成.
综上所述,BDE-3、BDE-47、BDE-100和BDE-153都是SRD5A1的抑制剂,BDE-100是AKR1C14抑制剂.这些PBDEs可通过阻断神经甾体合成途径调节神经甾体合成,而不影响神经甾体代谢.
神经甾体是一类类固醇激素,它通过与配体门控离子通道如GABA-A受体相互作用改变神经元兴奋性.研究发现,两种神经甾体,3α,5α-别孕烷醇酮(Allopregnanolone,ALLO)和3α,5α-雄甾烷二醇(3α,5α-androstanediol,DIOL)是有效的GABA-A受体激动剂.5α-还原酶1型(5α-reductasetype1,SRD5A1)、3α-羟基类固醇脱氢酶(3α-hydroxysteroiddehydrogenase,AKR1C14)和视黄醇脱氢酶2(Retinoldehydrogenase2,RDH2)参与其合成和代谢.在合成方面,SRD5A1和AKR1C14这两种类固醇生成酶是神经甾体合成的关键酶.SRD5A1位于脑细胞的光滑内质网中,其催化需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamideadeninedinucleotidephosphate,NADPH)作为辅助因子.SRD5A1将孕烯醇酮(Pregnenolone,P5)或睾酮(Testosterone,T)催化生成5α-二氢孕烯醇酮(5α-dihydropregnenolone,DHP)或5α-二氢睾酮(5α-dihydrotestosterone,DHT).AKR1C14属于醛酮还原酶家族,并在许多类固醇的3-位置加氢发挥还原作用.AKR1C14位于脑细胞的细胞质中,其催化需要NADPH作为辅助因子.AKR1C14分别将DHP和DHT催化成ALLO或DIOL.在代谢方面,RDH2是参与大鼠神经甾体代谢的关键酶.RDH2属于短链脱氢酶/还原酶家族,并从许多类固醇的3-位置除去氢.RDH2位于脑细胞的光滑内质网中,其催化需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamideadeninedinucleotide,NAD+)作为辅助因子.RDH2将ALLO和DIOL催化回DHP和DHT.
多溴联苯醚(Polybrominateddiphenylethers,PBDEs)是一类连接有1-10个溴原子的溴化烃.PBDEs通过光降解代谢成4-单溴联苯醚(4-monobromodiphenylether,BDE-3).PBDEs作为一种阻燃剂,被广泛应用在许多工业和消费品中.由于这些PBDEs化合物具有高度稳定性和持久性,因此PBDEs无处不在并造成严重而持久的环境污染.然而,它们对神经系统的潜在影响尚不清楚.本研究中,我们采用COS-1细胞培养和瞬时转染技术对SRD5A1、AKR1C14和RDH2的活性进行测定并采用酶动力学分析.在众多PBDEs中,我们选定了其中4种主要化合物作为参考,包括BDE-3、2,2,4,4-四溴联苯醚(Tetrabromodiphenylether,BDE-47)、2,2,4,4,6-五溴联苯醚(Pentabromodiphenylether,BDE-100)和2,2,4,4,6,6-六溴联苯醚(Hexabromodiphenylether,BDE-153).我们在转染的COS-1细胞中,比较了上述4种PBDEs和结构相似的4-溴联苯(4-bromobiphenyl,BBP)附着在1到6个溴原子的效力,来分析在转染的COS-1细胞中,4种不同的PBDEs抑制大鼠SRD5A1、AKR1C14和RDH2活性的效力,来观察PBDEs对大鼠神经甾体生物合成和代谢的影响及其机制.
研究方法:
将COS-1细胞等分铺在六孔板中,使每孔含有1.0×106个COS-1细胞,于37℃温度下进行过夜贴壁培养.COS-1细胞在含有炭剥离的胎牛血清的培养基中维持24h,细胞密度达到50-80%覆盖,进行细胞转染.每孔中加入1μgDNA以获得最大转染效率.24小时后,用0.01mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤转染的COS-1细胞,并在胰蛋白酶消化后收获并在补充有0.25M蔗糖的0.01mMPBS中匀浆.选择750×g离心10分钟以除去细胞核和大细胞碎片.将上清液转移至超速离心管中并以105,000×g离心两次以收集微粒体沉淀(用于SRD5A1和RDH2测定)和细胞质基质部分(用于AKR1C14测定).测定蛋白质浓度并最终稀释为20mg/ml,分别配成反应液.通过检测各底物生成物的放射峰值并计算底物到产物的转化百分比对SRD5A1、AKR1C14、RDH2的活性进行测定.采用酶动力学分析每种BDE在转染的COS-1细胞中对SRD5A1、AKR1C14和RDH2酶转化活性的抑制效力.
研究结果:
SRD5A1、AKR1C14和RDH2在辅因子和底物存在下的酶活性反应呈时间依赖性.SRD5A1、AKR1C14和RDH2反应在45-60分钟内显示出线性.
PBDEs对SRD5A1活性的影响显示SRD5A1的表观Km为2.852±0.149μM,表观Vmax为1.283pmol±0.208pmol/min.mg.在100μM时,上述化学物质也显著抑制SRD5A1活性,BDE-100和BDE-153的抑制率超过50%,BDE-3和BDE-47的抑制率约为50%,而BBP低于50%.这表明同其他化学物质相比,BDE-100和BDE153有显著的抑制作用.进一步的抑制剂-反应分析结果显示BDE-100和BDE-153的IC50值分别为0.367±0.078μM和0.876±0.066μM.当底物为睾酮时,BDE-100和BDE-153都是SRD5A1竞争性抑制剂.
AKR1C14的表观Km为2.981±0.270μM,表观Vmax为66.13pmol±2.260pmol/min.mg.在100μM的浓度下,只有BDE-100显著抑制AKR1C14活性.进一步对BDE-100进行抑制剂-反应分析,显示BDE-100的IC50值为5.665±0.055μM.
RDH2的表观Km为2.760±0.0336μM,表观Vmax为539.5pmol±2.427pmol/min.mg.在100μM,在所有测试的化学物中,没有一种显示出对RDH2活性的显著抑制.
研究结论:
BDE-3、BDE-47、BDE-100和BDE-153都是SRD5A1的特异性抑制剂,抑制大鼠SRD5A1的效力依次为BDE-100＞BDE-153＞BDE-47≥BDE-3＞BBP.且相对于SRD5A1,BDE-100、BDE-153、BDE47、BDE-3和BBP的半数抑制浓度(IC50)值分别为0.367、0.876、＞100、＞制剂,它可能通过与SRD5A1和AKR1C14与NADPH结合的相关位点结合从而导致脑内神经甾体合成受阻.
RDH2不是PBDEs的作用靶点.RDH2与SRD5A1和AKR1C14不同,因为它的辅助因子是NAD+,而SRD5A1和AKR1C14的辅助因子为NADPH.由于一些PBDEs通过与酶的辅助因子NADPH结合位点竞争来抑制SRD5A1和AKR1C14,所以PBDEs介导的抑制可能是通过NAD+和NADPH化学结构的差异进行调节.这表明PBDEs主要针对神经甾体合成.
综上所述,BDE-3、BDE-47、BDE-100和BDE-153都是SRD5A1的抑制剂,BDE-100是AKR1C14抑制剂.这些PBDEs可通过阻断神经甾体合成途径调节神经甾体合成,而不影响神经甾体代谢.