研究背景多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是单克隆浆细胞异常增生的恶性疾病,约占血液系统肿瘤10%。其临床表现复杂,包括贫血,骨骼病变,高钙血症,肾功能不全,免疫功能受损等。肾损伤是MM患者常见的合并症,发生率约在25%-50%。肾功能损伤对MM患者的肾预后有重要意义,研究表明,MM患者中位生存时间约为3年,而伴有肾损伤的MM患者中位生存时间仅为0.91年,并且肾功能衰竭是MM患者主要死亡原因之一,仅次于感染。MM患者肾损伤发生的机制是多因素作用的结果,尽管脱水、感染、高钙血症、药物肾毒性和造影剂等多因素可能导致肾功能损伤,但是主要机制是由大量分泌的单克隆轻链(light chain, LC),即本周氏蛋白(bence jones protein, BJP)所导致的。BJP可以引起肾脏损伤,形成“骨髓瘤肾(myeloma kidney)",其病理类型包括管型肾病(cast nephropathy, CN)、淀粉样变性(amyloidosis)、单克隆免疫球蛋白沉积病(monoclonal Ig deposition disease, MIDD)中的轻链蛋白沉积病(light chain deposition disease, LCDD)和Fanconi综合征等。管型肾病是MM肾损害最主要的因素,约占60%。大量BJP从肾小球滤过后进入肾小管,在远端小管中与Tamm-Horsfall蛋白(Tamm-Horsfall glycoprotein,THP)结合形成BJP管型,大量的BJP管型阻塞肾小管,导致管型肾病的发生,引起肾功能损害。研究发现虽然管型形成影响着管型肾病的发生发展,但BJP对肾小管上皮细胞直接毒性作用在管型肾病中也起着重要作用。Matsuura等人研究还发现某些BJP在体外细胞实验中能够对肾小管上皮细胞产生毒性作用,导致其凋亡坏死,BJP的这种毒性作用可能是其导致肾损伤的机制之一。然而,并不是所有分泌BJP的MM患者都发生肾损伤,可能与BJP某种特殊的理化性质有关。有学者研究显示BJP具有酰胺酶和DNA裂解活性,并证实BJP对肾脏的毒性作用与酰胺酶活性关系更加密切。淀粉样变性和轻链蛋白沉积病都是由于骨髓瘤细胞分泌的大量轻链蛋白及其片段异常沉积于肾组织引起的肾损害,临床上常表现为肾病综合征。轻链蛋白的类型在两者间的发病率不尽相同,在淀粉样变性中多见λ型轻链,而在单克隆免疫球蛋白沉积病中K型轻链约占70%,说明轻链蛋白特殊的结构可引起不同的病理改变。然而,人们对BJP的化学肾毒性仍未彻底了解。BJP水平与MM患者肾损伤并不一致。有的患者BJP高浓度但其肾功能并未发生损伤,相反有的患者BJP浓度水平较低,但其临床表现出肾损伤,表明BJP引起肾损害不仅是由分泌量决定的,还有BJP自身催化作用机制,导致肾损害的发生。目的本研究通过测定MM患者BJP酰胺酶催化作用水解底物后其吸光值的差值,根据Hanes作图法求得其催化常数Km值和催化效率kcat值。将BJP与猪肾小管上皮细胞(LLC-PKl)共同培养后,通过MTT法以及流式细胞仪检测细胞情况,观察LLC-PKl细胞的情况来明确BJP催化作用对肾小管细胞毒性作用的关系,明确BJP酰胺酶催化作用对MM肾损害发生的毒性机制。方法1BJP的提纯留取BJP阳性尿患者24h尿液,每1000ml加入261g固体硫酸铵,4℃过夜,离心弃上清；用PB液(PH7.0)溶解后透析除盐,浓缩；过Sephadex G-100柱,用PB液(PH7.0)洗脱,收集轻链峰,浓缩；用PB液(PH7.0)平衡后过DEAE Sepharose CL-6B柱,分管收集；洗脱峰各管用12%SDS-PAGE电泳鉴定后浓缩,分管放入-80℃冰箱保存。2LLC-PK1细胞培养猪肾小管上皮细胞LLC-PK1取自Hampshire猪肾组织,贴壁生长,用含血清8%的M199培养液培养,在37℃和5%CO2条件下培养,常规换液传代。3BJP酰胺酶催化作用的测定BJP具有酰胺酶活性,能够水解胰酶显色底物中Arg-pNA之间的酰胺键,苯甲酰-DL-精氨酸-p-硝基酰替苯胺盐酸盐(BANPA)含Arg-pNA键,本研究使用BANPA作为底物测定不同浓度下BJP催化反应的初始速度,采用米氏方程作图法得出BJP的Km和kcat值。取150u l37℃预热不同浓度(50、100、200、500、1000u mol/L)的BANPA加入50μ1BJP(终浓度为5mg/m1),对照组加入等量pH7.4,0.05mol/L的Tris缓冲液。37℃反应5min后,乙酸终止反应,使用酶标仪在405nm测光吸收值A,以空白组调零,计算出实验组与对照组吸光值差△A,使用Hanes作图法求得Km值和kcat值。4BJP对LLC-PK1细胞的抑制作用MTT比色法检测细胞增殖及增殖抑制率将LLC-PK1细胞密度接种于96孔板中,在37℃孵育24h后将M199培养液(无血清)中分别加入BJP(终浓度分别为2.5mg/ml、5mg/ml和10mg/m1)后再次放入37℃培养,对照组只加入等量的PBS,每组设3个复孔。培养24h后将各孔加入MTT20μ1,细胞放回培养箱继续培养4h后,吸出培养液加入二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)震荡溶解后,使用酶标仪测定各孔在570nm的吸光度A,计算细胞增殖抑制率。抑制率=(1-实验组A平均值／对照组A平均值)×100%。5BJP抑制LLC-PK1细胞增殖的作用机制流式细胞仪检测细胞凋亡坏死在含8%胎牛血清的M199培养液中常规传代培养LLC-PK1细胞接种于六孔培养板,培养24h贴壁,更换无血清培养液培养24h后,分别加入5、6、8号患者的BJP共同培养(终浓度分别为2.5mg/ml、5mg/ml和10mg/m1),对照组只加入等量的PBS,设3个复孔；24h后消化收集细胞,PBS洗涤两次。取1-5×105个细胞加入500μl结合液混匀后加入5μlAnnexin V-FITC和5μl PI溶液,室温下避光孵育,流式细胞仪分析。6统计学分析数据处理均用SPSS13.0软件进行统计分析。定量指标结果用均数±标准差(x±s)表示。仅对两个独立组均数比较时用成组t检验,当方差不齐时用Satterthwaite校正t检验。同一组的病人不同浓度的BJP的多组比较采用随机区组设计的两因素方差分析；两组间多重比较方差齐时用LSD检验,方差不齐时用Tamhane’sT2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。结果1MM患者的临床数据13例MM患者的均按《血液病诊断及疗效标准(第3版)》标准诊断明确。按照患者的血清肌酐值(serum creatinine, Scr)作为分组标准,将Scr≥178μ mol/L的患者作为有肾损组(n=5),Scr<178μ mol/L的患者为无肾损组(n=8),每组数据经独立样本t检验后可得肾损组患者Scr值显著高于无肾损组(P=0.044),而年龄、血尿素氮(BUN)、轻链定量、24h蛋白等其他因素两组比较差别无统计学意义(P=0.958,P=0.144,P=0.391,P=0.121)。2提纯BJP蛋白及SDS-PAGE电泳鉴定提取13例MM患者尿中BJP,其中有K型8例和λ型5例,提纯后的BJP通过SDS-PAGE电泳进行鉴定。免疫球蛋白轻链分子量约为25kD,在体内K轻链常以单体形式存在；λ轻链则常以非共价结合形成的二聚体,通过SDS-PAGE电泳,K型轻链可见在分子量25kD处有单一条带,而λ型轻链可见在分子量25kD和50kD处有两条条带。3BJP酰胺酶催化作用的测定3.1BJP Km值和kcat值酶的催化作用强弱常由酶动力学指标米氏常数Km值和催化常数kcat值来反映,Km值反映酶与底物的亲和力大小；kcat值反映底物饱和状态下酶催化反应的速度,Kcat越大,表示酶的催化效率越高。采用Hanes作图法计算得到结果显示各BJP的Km值都在10-4mol/L数量级间,不同BJP的kcat值差异较大,而7、10号患者BJP计算得出Km值为负值,无意义。3.2BJP催化作用最适PH值的测定由3.1可得出,5、6、8号BJP的kcat值约是其他BJPkcat值的5-40倍,遂将这三份BJP分别于一系列PH值(5.5、6.0、6.5、7.0、7.4、8.0)下以BAPNA为反应底物测其催化作用,结果发现BJP在PH为7.0-8.0时催化作用较强,在PH7.4时催化作用最强。随着PH的继续降低或升高,BJP的kcat值下降,催化作用减弱。4BJP对LLC-PK1的抑制作用MTT比色法检测细胞增殖抑制率将不同浓度(2.5mg/ml、5mg/ml和10mg/m1)BJP与LLC-PK1细胞共同培养24h用MTT处理后测得组别的不同吸光值,肾损组在三个浓度下的增殖抑制率分别为：7.4±4.5、13.3±9.4、21.1±13.6；无肾损组在三个浓度下的增殖抑制率分别为：1.9±3.3、1.3±4.9、1.7±3.9。两组间相同浓度下吸光值A经t检验发现,肾损组BJP在三个浓度下对LLC-PK1细胞增殖抑制率都显著高于无肾损组(P=0.050,P=0.045,P=0.040)。将13份BJP在2.5mg/ml、5mg/ml和10mg/m1浓度下的细胞增殖抑制率与对照组经t检验比较发现,5、6、8号BJP在三个浓度下引起的细胞增殖抑制率与对照组都有显著差异(P=0.028,P=0.049,P=0.018,P=0.010,P=0.006,P=0.002,P=0.003,P=0.006,P=0.001),而其他10份BJP未产生明显抑制作用。5BJP酰胺酶催化作用与其细胞抑制作用的关系在MTT法中,可以观察到5、6、8号患者BJP能够明显抑制LLC-PK1细胞增殖,具有明显的细胞增殖抑制作用。将5、6、8号患者BJP在不同浓度下的细胞增殖抑制率和其kcat值经Spearman相关分析得出BJP的kcat值与BJP在2.5mg/ml、5mg/ml和10mg/ml三个浓度下的细胞抑制率相关性有统计学意义,kcat值与三个浓度下细胞抑制率的相关系数分别为0.837(P=0.003)、0.872(P=0.002)、0.833(P=0.002)。由此可以得出BJP的kcat越大,细胞增殖抑制率越高,两者为正相关。6BJP抑制LLC-PK1细胞增殖的作用机制流式细胞仪检测细胞凋亡坏死将LLC-PKl细胞与能够明显抑制细胞增殖的5、6、8号BJP在不同浓度下共同培养24h后,通过流式细胞仪检测得到对照组、2.5mg/ml组、5mg/ml组和10mg/ml组坏死比例分别为5.1±0.3、9.3±3.0、13.3±2.2和22.0±6.4,凋亡比例分别为0.7±0.1、1.9±0.1、2.7±0.4、5.9±0.7。将同一组的病人不同浓度的BJP导致细胞的坏死率和凋亡率的多组比较采用随机区组设计的两因素方差分析；经Levene方差齐性检验,三组总体方差齐性(P=0.053,P=0.082),两组间多重比较方差齐时用LSD检验进行统计学分析。与对照组相比,5mg/ml和10mg/ml浓度BJP作用的LLC-PK1细胞坏死显著增多(P=0.026,P=0.000),与中低浓度(2.5mg/ml和5mg/ml)相比,高浓度(10mg/ml)BJP诱导细胞发生坏死的比例显著增多(P=0.003,P=0.018)。与对照组相比,2.5mg/ml、5mg/ml和10mg/ml浓度BJP作用的LLC-PK1细胞凋亡显著增多(P=0.007,P=0.000,P=0.000),与中低浓度(2.5mg/ml和5mg/ml)相比,高浓度(10mg/ml)BJP诱导细胞发生坏死的比例显著增多(P=0.000,P=0.000)。结合坏死及凋亡的数值变化,提示坏死及凋亡占有相当比重,且坏死占主要部分。结论1、部分BJP具有酰胺酶活性,且酰胺酶催化作用强弱不同。临床表现出肾损伤的MM患者BJP酰胺酶催化作用较未出现肾损伤的患者强。2、BJP能够引起LLC-PK1细胞产生坏死和凋亡,且坏死比例大于凋亡。3、BJP对肾小管上皮细胞的毒性作用随浓度的增加而增强,浓度越高,LLC-PK1细胞坏死和凋亡的比例越高。4、BJP酰胺酶的催化作用与其毒性作用相关,催化作用越强,LLC-PK1细胞增殖抑制率越高。