研究背景与目的阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）患者最初表现为近记忆力下降,随疾病进展认知功能出现全面衰退,最终生活不能自理。目前全球约有5000万痴呆患者,AD约占痴呆总数的2/3,成为我国第五大死因。由于全球人口老龄化的加剧,该病患病形势严峻,是全人类亟需解决的健康难题。该病目前尚无根治办法,但如果尽早进行干预治疗,能一定程度延缓疾病进展,提高患者生活质量。科学家们一直在努力开发AD的新药,但多以失败告终,重要的原因是研究窗口太靠后,其实在症状出现前15到20年患者脑部就开始出现AD的病理改变,因此早期诊断AD尤为重要。生物标志物对AD诊断的重要性已成为共识,尤其对无临床症状的超早期患者。目前脑脊液amyloid-beta42（Aβ42）和tau蛋白是公认的体液标志物,但由于腰椎穿刺的有创性,AD患者的脑脊液获取困难,限制了其广泛应用。淀粉样蛋白PET能活体显示脑内Aβ的沉积情况,可作为有前途的影像标志物,但鉴于PET-CT扫描的高成本及需要特殊的示踪剂,目前多用于科学研究,基层医院难以常规开展。因此临床上仍缺乏创伤小的、廉价的、病人易于接受的AD标志物。散发性AD病因复杂,发病机制尚不完全明确,研究显示,外泌体和lncRNA参与了 AD的病理生理过程。外泌体能够参与神经元再生、发育和突触形成,含有与AD发病密切相关的蛋白,如全长的APP、β-分泌酶和Aβ,并可在神经细胞间转移毒性蛋白。外泌体可自由穿过血脑屏障,并可在多种体液中检出。外泌体可作为神经系统疾病如帕金森病、朊蛋白病等的生物标志物研究的载体。长链非编码RNA（long noncoding RNAs,lncRNAs）影响疾病的发生主要通过参与基因的表观遗传、转录和转录后调控。LncRNA在脑中表达丰富,可通过调节Aβ的生成、氧化应激、突触损伤、线粒体功能等参与AD发病。研究发现,AD患者脑组织标本存在多种表达异常的lncRNA。结构磁共振成像（Structural magnetic resonance imaging,sMRI）在临床上应用广泛,结合计算机影像分析技术使得成像更接近于颅脑解剖,能够精确显示脑萎缩部位、程度及各个脑区的结构,并能排除其他脑部疾病所致的认知功能障碍,是最常用于痴呆诊断及鉴别诊断的影像手段。综上所述,AD的病理过程证实有外泌体和lncRNA的参与,并且它们均能在外周血中检测到;结构MRI能清晰反映脑萎缩程度并能动态观察疾病进展的过程,且大多数痴呆病人都能配合完成。因此,外泌体、lncRNA和sMRI均可作为研究AD标志物的理想途径。本研究选取了几种在AD患者大脑中表达上调的lncRNAs,验证其在外周血外泌体中的表达情况,同时应用自动化软件分析受试者内侧颞叶亚区的sMRI数据,以期寻找临床实用的、可操作性强的、易于常规开展的AD诊断标志物。研究对象收集2014年5月至2019年7月就诊于山东大学第二医院的AD患者72例,符合2011年美国国立老化研究所和阿尔茨海默病协会（NIA-AA）的AD诊断标准（很可能的）,排除其他可导致认知功能障碍的疾病。随机选取62例同时期在我院查体的健康者为对照,他们认知功能正常,且在性别、年龄、受教育程度等方面与AD组相匹配。所有受试者均进行神经心理量表测试及颅脑MRI和（或）CT扫描,收集受试者血压、血糖、血脂、发病时间、抽烟饮酒情况等一般临床信息。本研究所有受试者签署了知情同意书（由其本人或其委托人）,并获得山东大学第二医院伦理委员会的批准。统计方法本研究的统计分析及图表制作通过应用SPSS24.0和GraphPad Prism 5.0软件完成。首先,针对连续型数据,检验其是否符合正态分布。对符合正态分布的数据用“均数±标准差”表示,偏态分布的数据表示为“中位数（上四分位数,下四分位数）”,用“频率和百分比”表示分类变量数据。应用Student’s t检验或Mann-Whitney U检验进行两组间数据的比较。分类变量间比较采用卡方（chi-square）test;应用单因素方差分析或Kruskal-Wallis秩和检验进行多组间数据比较。应用Pearson或Spearman秩相关进行两个变量间的相关性分析。应用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic,ROC）分析评估曲线下面积（area under the curve,AUC）,评估目的RNA的灵敏度、特异度、准确性、约登指数、截断值。P<0.05表示有统计学差异。研究方法1.第一部分血浆外泌体来源的IncRNAs作为AD外周生物标志物的研究空腹抽取外周静脉血5ml,立即提取血浆外泌体,进行以下研究:（1）应用Western Blot检测外泌体的标志蛋白,纳米颗粒跟踪分析（NTA）测量粒径大小和浓度,电子显微镜（TEM）观察其形态和大小。（2）应用实时荧光定量PCR（Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测目的 RNA（包括 lncRNA BACE1-AS,51A,BC200,17A 和 BACE1 mRNA）在外周血外泌体中的表达情况,寻找在AD和对照组中差异表达的RNA。（3）将差异表达的lncRNAs与临床数据（如年龄、发病时间、MMSE得分、血脂等）进行相关性分析,并根据CDR得分进行痴呆程度划分,进行AD亚组间lncRNAs的比较。（4）对差异表达的lncRNAs进行ROC曲线分析和诊断效能评价,计算AUC、灵敏度、特异度、准确性、约登指数、最佳截断值,筛选AD的外周血标志物。2.第二部分内侧颞叶亚区sMRI作为AD影像生物标志物的研究对依从性好的受试者进行3.0T MRI的3D-BRAVO序列薄层扫描,采集T1轴位数据,进行以下研究:（1）应用计算机影像分析软件（FreeSurfer）进行内侧颞叶4个主要亚区（包括海马、海马旁回、内嗅皮层和杏仁核）的皮层体积、平均厚度、表面积、平均曲率（共20个指标）的数据分析,寻找在AD和对照中有差异的sMRI指标。（2）根据CDR得分进行痴呆程度划分,在AD亚组间进行MRI数据比较。（3）应用神经精神评分（NPI）对痴呆患者的精神症状进行评价,根据有无精神症状将AD患者分成2个亚组,进行MRI数据的比较分析。（4）对两组间有差异的sMRI指标进行ROC曲线分析和诊断效能评价,计算AUC、灵敏度、特异度、准确性、约登指数、最佳截断值,筛选AD的影像标志物。3.第三部分 血浆外泌体lncRNAs与内侧颞叶亚区sMRI指标的相关性分析对在AD和对照中差异表达的lncRNAs和内侧颞叶亚区sMRI指标进行相关性分析,探讨外周血外泌体lncRNA参与AD脑萎缩的临床证据和可能机制。4.第四部分 血浆外泌体lncRNAs与内侧颞叶亚区sMRI指标联合诊断AD的探讨进行以下研究:（1）分别应用串联和并联试验,对在AD和对照中差异表达的lncRNAs和内侧颞叶亚区sMRI指标进行联合诊断探索分析。（2）对上述有差异的指标构建Logistic回归模型,筛选效能更高的联合诊断AD的标志物。研究结果1.第一部分 血浆外泌体lncRNAs可作为潜在的AD外周生物标志物（1）血浆外泌体的鉴定Western blot结果显示,本研究所提取的外泌体可检测到两种外泌体标志蛋白:ALIX和CD63;应用电子显微镜观察到我们提取的外泌体为球形囊泡,直径在30-150 nm之间。NTA显示我们提取的颗粒直径为16.5-478.3 nm,其中99.7%颗粒的直径为98.9nm左右。由此可见,我们提取的物质符合外泌体的特征。（2）血浆外泌体RNA表达情况经Mann-Whitney U test统计分析发现,BACE1-AS和17A在AD患者血浆外泌体中的表达水平明显升高（P<0.05）;其余RNA在两组间无明显统计学差异（P>0.05）。（3）BACE1-AS和17A与临床数据的相关性分析AD患者外周血甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、总胆固醇（TC）及男性病人的血红蛋白（Hb）水平较正常对照降低（P<0.05）。分别对BACE1-AS和17A与上述临床指标进行相关性分析,结果显示,BACE1-AS和17A表达水平与上述指标均无明显相关性（P>0.05）。为进一步探索BACE1-AS和17A表达水平是否与年龄、发病时间及疾病严重程度相关,将这2个lncRNAs与受试者的年龄、AD的发病时间及MMSE得分进行相关性分析。结果显示,BACE1-AS和17A与上述各指标无明显相关性（P>0.05）。根据CDR评分将AD患者分为轻中重度3个亚组,应用Kruskal-Wallis检验进行3个亚组间的BACE1-AS和17A表达水平比较及事后两两比较。结果发现,各亚组AD患者的2个lncRNAs表达水平均高于对照,但在各亚组间无显著差异（P>0.05）。（4）对BACE1-AS和17A进行ROC曲线分析和诊断效能评价计算 BACE1-AS 曲线下面积 AUC 为 0.761（95%CI,0.675-0.848;P<0.001）,BACE1-AS诊断AD的灵敏度为87.5%,特异度为61.3%,准确性为75.37%,最佳截断值为0.623。计算 17A 的 AUC 为 0.633（95%CI,0.5324-0.7335;P=0.012）,17A 区分 AD与对照的灵敏度为83.05%,特异度为45.90%,准确性为64.17%,最佳截断值为0.595。结论:血浆外泌体lncRNABAEC1-AS和17A能较好地区分AD患者和认知正常者,且这2个lncRNAs在不同痴呆程度AD中稳定表达,可作为诊断AD的潜在外周血标志物,且BAEC1-AS较17A有更好的诊断效能。2.第二部分内侧颞叶亚区sMRI可作为AD的候选影像标志物因磁共振分析软件对扫描参数要求严格,仅对22例AD患者和26例对照者进行了 MRI数据分析,两组在性别、年龄和学历等方面相匹配。2.1内侧颞叶亚区sMRI数据分析2.1.1海马AD患者左侧海马体积为3666.01±1188.36 mm3,对照者为4085±775.80mm3;AD患者右侧海马体积为3926.13±871.56 mm3,对照者为4238.11±756.22mm3,应用Student’s t-test进行两组间数据比较,发现双侧海马体积在两组间无明显统计学差异（P>0.05）。2.1.2内嗅皮层AD患者右侧内嗅皮层体积为 1114.68±588.63mm3,对照组为1484.50±365.55mm3,Student’s t-test 发现 AD 较对照明显减小（P<0.05）。AD患者右侧内嗅皮层平均厚度为2.69±0.44mm,对照组为2.97±0.38mm,统计分析显示AD较对照明显减小（P<0.05）。其余内嗅皮层sMRI数据在两组间无明显统计学差异（P>0.05）。2.1.3海马旁回应用Student’s t-test进行两组数据间比较,发现双侧海马旁回各指标在两组间无明显统计学差异（P>0.05）。2.1.4杏仁核AD 患者左侧杏仁核体积为 1170.75±402.63mm3,对照组为1559.65±289.02mm3,进行Student’s t-test检验显示,AD较对照明显减小（P<0.01）。AD患者右侧杏仁核体积为 1342.01±307.68mm3,对照组为1629.97±250.24mm3,Student’s t-test 显示 AD 较对照明显减小。2.2 ROC曲线分析和诊断效能评价如上所述,AD患者的4个内侧颞叶亚区指标（包括右侧内嗅皮层体积、右侧内嗅皮层厚度、双侧杏仁核体积）较对照组明显减小。为评估它们的诊断价值,进行ROC曲线分析。2.2.1右侧内嗅皮层体积计算 AUC 为 0.761（95%CI:0.527-0.850,P<0.05）,诊断 AD 的灵敏度为 59.1%,特异度为84.6%,准确性为72.92%,约登指数为0.437,截断值为1142.5。2.2.2右侧内嗅皮层平均厚度计算 AUC 为 0.689（95%CI:0.536-0.843,P<0.05）,诊断 AD 的灵敏度为 80.8%,特异度为59.1%,准确性为68.75%,约登指数为0.399,截断值为2.705。2.2.3左侧杏仁核体积计算AUC为0.761（95%CI:0.623-0.898,P<0.01）,诊断AD的灵敏度为80.8%,特异度为63.6%,准确性为72.91%,约登指数为0.444,截断值为1358。2.2.4右侧杏仁核体积计算 AUC 为 0.771（95%CI:0.635-0.907,P<0.01）,诊断 AD 的灵敏度为 88.5%,特异度63.6%,准确性为77.08%,约登指数为0.521,截断值为1472。2.3内侧颞叶亚区sMRI与临床资料2.3.1内侧颞叶亚区的sMRI与痴呆严重程度应用CDR评分对AD患者进行痴呆严重程度分级:轻度AD4例,中度AD10例,重度AD8例。（1）应用单因素方差分析进行3个AD亚组间的比较,发现右侧内嗅皮层体积和厚度在3组间有显著差别,两两比较发现内嗅皮层厚度在轻、中度AD间有明显差别（P=0.019）;右侧内嗅皮层体积在轻度和重度AD间有明显差别（P=0.036）。（2）应用单因素方差分析进行3个AD亚组间数据比较,发现双侧海马体积在3组间无明显差别,但是各痴呆程度的AD患者海马体积均小于对照组。（3）其余磁共振指标在3个亚组间无明显差别（P>0.05）。2.3.2内侧颞叶亚区sMRI与精神症状神经精神（NPI）评分发现13例AD患者存在精神症状。（1）根据有无精神症状将AD患者分为2组,应用Student’s t-test分析20个MRI指标,发现双侧杏仁核体积及左侧海马体积在2组间差别明显,有精神症状的患者萎缩更为严重（P=0.0002;P=0.042;P=0.009）。（2）对有精神症状的AD患者进行NPI总分及照料者痛苦程度总分的计算,并与双侧杏仁核体积及左侧海马体积进行相关性分析。结果显示,两者间无明显相关性（P>0.05）。2.3.3左右两侧内侧颞叶亚区数据的比较应用Student’s t-test比较双侧杏仁核、双侧海马和海马旁回、双侧内嗅皮层各指标,发现左右两侧无明显差别（P>0.05）。2.3.4内侧颞叶亚区不同性别间的比较应用Student’s t-test比较不同性别的20个内侧颞叶MRI指标,发现各指标在男性AD病人（n=11）和女性病人（n=11）间无明显差别（P>0.05）。2.3.5内侧颞叶亚区与MMSE得分的相关性经Pear son相关性分析发现,20个内侧颞叶MRI指标与AD患者MMSE得分无明显相关性（P>0.05）。2.3.6内侧颞叶亚区与发病时间的相关性经Pearson相关性分析发现,20个内侧颞叶MRI指标与AD发病时间无明显相关性（P>0.05）。结论:本研究发现右侧内嗅皮层体积、右侧内嗅皮层厚度及双侧杏仁核体积在AD患者中较对照组明显减小,诊断试验显示以上4个指标可作为诊断AD的潜在影像标志物。CDR痴呆亚组分析发现,右侧内嗅皮层厚度在轻中度AD间有明显差别,右侧内嗅皮层体积在轻度和重度AD间有明显差别。NPI亚组分析发现,双侧杏仁核体积及左侧海马体积在2组间差别明显,有精神症状的患者萎缩更为严重。3.第三部分血浆外泌体lncRNAs与内侧颞叶亚区sMRI指标的相关性3.1 BACE1-AS 与 sMRI 指标分别对48位受试者的内侧颞叶亚区的20个sMRI指标与其相应的血浆外泌体BACE1-AS表达水平进行Spearman相关性分析,发现右侧杏仁核体积与BACE1-AS 存在相关性（r=-0.482,95%CI=-0.6820 to-0.2139,P=0.001）。3.2 17A 与 sMRI 指标分别对48位受试者的内侧颞叶亚区的20个sMRI指标与其相应的血浆外泌体17A表达水平进行Spearman相关性分析,未发现明显相关性。结论:本研究首次探讨了血浆外泌体lncRNA BACE1-AS和17A与内侧颞叶亚区sMRI数据的相关性,发现AD患者的右侧杏仁核体积与血浆外泌体BACE1-AS表达水平呈负相关,我们推测BACE1-AS可能通过外泌体途径参与AD脑杏仁核萎缩。4.第四部分血浆外泌体lncRNAs与内侧颞叶亚区sMRI联合诊断AD如前所述,我们发现2个血浆外泌体lncRNA和4个sMRI指标可作为潜在的AD标志物。但是,单一指标很难同时有较高的灵敏度和特异度,为了提高诊断效能,我们应用联合诊断试验和二分类Logistic回归模型进行各指标联合诊断的探讨。4.1联合诊断试验分别应用串联和并联诊断试验,对在AD和对照中差异表达的2个lncRNA（BACE1-AS、17A）和内侧颞叶亚区的4个sMRI指标（右侧内嗅皮层体积、右侧内嗅皮层厚度、左侧杏仁核体积和右侧杏仁核体积）进行联合诊断探索分析,结果如下:（1）BACE1-AS和17A:串联时灵敏度为59.09%,特异度为80.77%,准确性为70.83%,约登指数为0.399;并联时灵敏度为86.36%,特异度46.15%,准确性64.58%,约登指数为0.325。（2）4个内侧颞叶亚区指标:串联时灵敏度为22.73%,特异度为100%,准确性为64.58%,约登指数为0.227;并联时灵敏度为77.27%,特异度为69.23%,准确性为72.92%,约登指数为0.465。（3）BACE1-AS和4个内侧颞叶亚区指标:串联时灵敏度为22.73%,特异度为100%,准确性为64.58%,约登指数为0.227;并联时灵敏度为100%,特异度为0%,准确性为45.83%,约登指数为0。（4）17A和4个内侧颞叶亚区指标:串联时灵敏度为18.18%,特异度为100%,准确性为62.5%,约登指数为0.182;并联时灵敏度为100%,特异度为30.77%,准确性为62.5%,约登指数为0.308。（5）2个lncRNAs和4个内侧颞叶亚区指标:串联时灵敏度为18.18%,特异度为100%,准确性为62.50%,约登指数为0.182;并联时灵敏度为100%,特异度为23.08%,准确性为58.33%,约登指数为0.231。（6）BACE1-AS和2个右侧内嗅皮层指标（体积和厚度）:串联时灵敏度为36.36%,特异度为96.15%,准确性为68.75%,约登指数为0.325;并联时灵敏度为90.91%,特异度为42.31%,准确性为64.58%,约登指数为0.332。（7）BACE1-AS和右侧杏仁核体积:串联时灵敏度为59.09%,特异度为88.46%,准确性为88.46%,约登指数为0.476;并联时灵敏度为86.36%,特异度为61.54%,准确性为72.92%,约登指数为0.479。（8）双侧杏仁核体积:串联时灵敏度为45.45%;特异度为92.31%;准确性为70.83%,约登指数为0.378;并联时灵敏度为81.82%;特异度为76.92%;准确性为79.17%,约登指数为0.587。（9）17A和双侧杏仁核体积:串联时灵敏度为27.27%,特异度为96.15%,准确性为64.58%,约登指数为0.234;并联时灵敏度为95.45%,特异度为46.15%,准确性为68.75%,约登指数为0.416。（10）BACE1-AS和双侧杏仁核体积:串联时灵敏度为40.91%,特异度为92.31%,准确性为68.75%,约登指数为0.332;并联时灵敏度为95.45%,特异度为53.85%,准确性为72.92%,约登指数为0.493。（11）17A和4个内侧颞叶亚区:串联时灵敏度18.18%,特异度为100%,准确性为62.5%,约登指数为0.182;并联时灵敏度为100%,特异度为30.77%,准确性为62.5%,约登指数为0.308。（12）右侧内嗅皮层体积和厚度:串联时灵敏度为40.91%,特异度为92.31%,准确性为68.75%,约登指数为0.332;并联时灵敏度为72.73%,特异度为73.08%,准确性为72.92%,约登指数为0.458。4.2回归模型的建立应用二分类Logistic回归分析,对两组间有差异的6个指标进行组合分析,构建疾病预测模型,构建3个成功的模型。（1）BACE1-AS联合右侧内嗅皮层体积和厚度回归模型 1:Logit（P=AD）=4.613+0.281×BACE1-AS-1.375×右侧内嗅皮层厚度。ROC曲线分析显示AUC为0.747,灵敏度76.2%,特异度76.9%,准确性76.6%,约登指数为0.531。（2）BACE1-AS联合右侧内嗅皮层体积和厚度,纳入年龄性别回归模型 2:Logit（P=AD）=-2.013+0.389×BACE1-AS-1.317×右侧内嗅皮层厚度+0.081×年龄。ROC曲线分析显示AUC为0.819,灵敏度81%,特异度73.1%,准确性76.6%,约登指数为0.541。（3）17A联合右侧内嗅皮层体积和厚度,纳入年龄性别回归模型 3:Logit（P=AD）=-1.67-0.146×17A-1.789× 右侧内嗅皮层厚度+0.108×年龄。ROC曲线分析显示AUC为0.850,灵敏度77.8%,特异度76.9%,准确性77.08%,约登指数0.547。结论:1.BACE1-AS和双侧杏仁核体积的并联试验以及17A和双侧杏仁核体积的并联试验,拥有较好的灵敏度,达到95.45%,并且有一定的特异度,准确性和真实性也较好。17A和4个内侧颞叶亚区指标的并联试验以及2个lncRNAs和4个内侧颞叶亚区指标的并联试验,筛查AD的灵敏度达到100%,但是特异度偏低。2.构建了 3个诊断AD的Logistic回归模型,其中模型2和3诊断效能明显优于单个指标。创新性和意义1.本研究发现了 2个血浆外泌体lncRNAs和4个内侧颞叶亚区sMRI指标在AD患者中有显著差异,可作为诊断AD的候选标志物。2.本研究首次发现AD患者的右侧杏仁核体积与血浆外泌体BACE1-AS表达水平呈负相关,为BACE1-AS可能通过外泌体途径参与AD脑萎缩提供了临床证据。3.本研究首次利用串并联试验和Logistic回归模型对血浆外泌体lncRNAs和内侧颞叶亚区多个sMRI指标进行联合诊断探讨,发现了多个诊断模型标志物,能显著提高AD的诊断效能。4.本研究为临床提供了多个新的、实用性强的、易于常规开展的AD诊断标志物,有助于AD的早期诊断和治疗。