第一部分磁共振定量参数评估胃癌裸鼠肿瘤生长活性的研究研究背景胃癌（Gastric cancer,GC）是一种起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤,其发病率在我国各种恶性肿瘤中居首位。胃癌发病具有明显的地域性差别,我国的西北地区的胃癌发病率明显高于东南地区。胃癌好发年龄在50岁以上,男性与女性发病率之比约为2:1。由于饮食结构改变、工作压力增大及幽门螺杆菌感染等原因,使得胃癌发病呈现年轻化倾向。目前我国胃癌的早期诊断率仍然较低,治疗手段仍以外科手术治疗为主,放化疗为辅,因此对胃癌患者进行准确的术前诊断及临床分期尤为重要。然而胃癌的癌变过程是一个多因素、多步骤、多阶段的发展过程,涉及癌基因、抑癌基因、凋亡相关基因以及转移相关基因等的改变,基因改变的形式也是多种多样。随着影像学技术不断发展,越来越多的MR功能成像技术应用于肿瘤的诊断与评估,扩散加权成像（Diffusion-weighted imaging,DWI）就是其中一种,可以通过施加扩散敏感梯度场（b值）,观察肿瘤内水分子的扩散情况,从而计算出表观扩散系数（Apparent diffusion coefficients,ADC）值,ADC值越大说明水分子扩散能力越强,ADC值减低,则提示扩散受限,最终可以通过ADC值定量反映组织微观结构变化。体素内不相关运动成像（Intravoxel Incoherent Motion,IVIM）是多b值DWI成像,并且在近几年越来越受到重视并广泛应用于临床研究中。在生物组织中,IVIM包括单纯水分子扩散运动和血液灌注两种因素。体素内不相干运动成像不仅可以提供肿瘤组织内代表单纯水分子扩散运动的纯分子扩散系数（D）,还可以反映肿瘤组织血流灌注的假扩散系数（D*）、灌注比例（f）,预测肿瘤组织的生长活跃程度,评估肿瘤治疗疗效。本课题研究 ARHGEF10L（Rho guanine nucleotide exchange factor 10-like protein,鸟苷酸交换因子10L）属于GEF家族蛋白,激活RhoA由无活性GDP-RhoA状态转化为有活性GTP-RhoA状态,从而发挥多种生物学功能。文献报道,ARHGEF10L基因位于染色体1p36区域,并且与卵巢癌、肝癌等肿瘤发生密切相关。胃癌肿瘤组织由于细胞成分高、含水量低,水分子扩散受限;通过降低ARHGEF10L蛋白表达,肿瘤组织内部的细胞数量、密度及血液供给等都会发生相应变化,从而通过磁共振IVIM评估其对肿瘤组织生长的影响。以往磁共振IVIM主要应用于乳腺癌、肝癌等人体肿瘤的研究,对动物肿瘤模型的研究相对较少。本研究拟从动物模型水平观察ARHGEF10L对裸鼠胃癌组织生长的影响,探讨磁共振IVIM定量参数（ADC、D、D*、f值）评估裸鼠肿瘤生长的应用价值,从而为肿瘤基础研究提供一种新的评价方法。研究目的利用磁共振分子功能成像定量参数评估胃癌裸鼠肿瘤生长活性,探讨ARHGEF10L对胃癌细胞生长的影响。研究方法1、本研究选用4-5周BALS/C Nude裸鼠构建裸鼠皮下成瘤模型,随机将裸鼠分为实验组（n=10）和对照组（n=10）,分别皮下注射对照组和干扰ARHGEF10L组的慢病毒细胞,构建胃癌裸鼠动物模型。2、采用GE Discovery 750 3.0T磁共振扫描仪和小动物线圈,分别对荷瘤裸鼠进行多b值DWI扫描,分别选取10个b值10、20、30、40、50、80、100、150、200、400 s/mm2,采用轴位自旋回波序列进行扫描;同时采用GE后处理工作站AW 4.6软件系统对IVIM图像进行分析,测量定量参数ADC值、D值、D*值、f值;最后采用SPSS 17.0软件进行统计学分析,检测数据正态分布和方差齐性,独立样本t检验用于比较两组之间差异性分析,p<0.05被认为差异具有统计学意义。研究结果对照组（CON）和干扰ARHGEF10L组（shARHGEF10L）的肿瘤ADC值分别为 2.39±0.24×10-4mm2/s、4.13±0.21×10-4mm2/s（P<0.001）,两组之间差异存在统计学意义;与对照组（CON）ADC值相比,干扰ARHGEF10L组（shARHGEF10L）ADC值较高,说明干扰ARHGEF10L后肿瘤水分子扩散受限减弱,提示ARHGEF10L可能促进胃癌细胞生长。对照组（CON）和干扰ARHGEF10L 组（shARHGEF10L）的肿瘤 D 值分别 6.81±0.21 × 10-3mm2/s 和 8.03±0.13 × 10-3mm2/s,（P<0.001）,两组之间差异存在统计学意义,与对照组（CON）D值相比较,干扰ARHGEF10L组（shARHGEF10L）D值较高,说明干扰ARHGEF10L后肿瘤真实水分子扩散受限减弱,同样提示ARHGEF10L可能促进胃癌细胞生长活。对照组（CON）和干扰ARHGEF10L组（shARHGEF10L）的肿瘤D*值分别为4.37±0.15 × 10-2mm2/s、4.55±0.17× 10-2mm2/s,P>0.05;对照组（CON）和干扰ARHGEF10L组（shARHGEF10L）的肿瘤f值分别为0.21 ±0.02、0.17±0.01,P>0.05;对照组和干扰ARHGEF10L组的D*值、f值差异不存在统计学意义。结论1、磁共振IVIM定量参数ADC值、D值可以有效评估胃癌裸鼠肿瘤生长活性。2、磁共振分子功能成像定量参数提示ARHGEF10L可能促进胃癌细胞生长。第二部分 探究ARHGEF10L参与胃癌致病过程的机制研究研究背景作为鸟苷酸交换因子家族蛋白（RhoGEF）之一,鸟苷酸交换因子10L（Rho guanine nucleotide exchange factor 10-Like 1,ARHGEF10L）位于染色体 1p36 区域,编码GrichGEF蛋白,可以激活RhoA由无活性GDP-RhoA状态转化为有活性GTP-RhoA状态,进一步参与细胞增殖、细胞迁移、细胞凋亡等多种生物学功能。文献报道位于ARHGEF10L基因上的两个SNP位点（rs2256787和rs10788679）可以增加子宫内膜样卵巢癌（endometrioid epithelial ovarian cancer）、浆液性卵巢癌（serous epithelial ovarian cancer）的致病率。另外最近文献报道,在肝细胞癌中,ARHGEF10L基因上的两个SNPs位点（rs2244444、rs12732894）与肝癌发生密切相关,同时在肝细胞癌中ARHGEF10L蛋白表达水平增高,可以通过活化GTP-RhoA-ROCK1-Phospho ERM促进肝细胞癌的致病过程。但是ARHGEF10L参与胃癌致病过程的具体作用机制目前仍然不清楚。研究目的研究ARHGEF10L蛋白在胃癌组织中蛋白表达情况,对胃癌细胞增殖能力、细胞迁移能力以及EMT作用的影响,进一步探讨其可能参与的信号通路,深入研究ARHGEF10L参与胃癌致病过程的作用机制。研究方法1、在山东省千佛山医院收集临床胃癌组织和癌旁组织（n=6）,分别提取组织蛋白质,应用Western blot方法检测ARHGEF10L蛋白在胃癌组织和癌旁组织中的表达情况,并进行统计学分析。2、购买培养SGC7901胃癌细胞系,应用转染试剂PolyJetTM In Vitro DNA（SignaGen,USA）分别将对照组质粒（pcDNA3.1-RFP）和过表达 ARHGEF10L质粒（pcDNA3.1-ARHGEF10L-RFP）转染胃癌细胞中,72小时后收集细胞,分别提取细胞蛋白质,应用western blot方法检测ARHGEF10L蛋白表达以确定ARHGEF10L过表达效率。同时在SGC7901细胞中进行Cell Counting Kit-8实验、Transwell实验以及血管形成实验,分析研究过表达ARHGEF10L蛋白对胃癌细胞增殖、迁移、血管形成能力的影响,并进行统计学分析。3、培养胃癌细胞系SGC7901,应用转染试剂PepMuteTM siRNA Transfection Reagent 分别将对照组 RNA（Allstars）和干扰 ARHGEF10L 组 RNA（Anti-ARHGEF10L siRNA）转染胃癌细胞系中,72小时后收集细胞并且提取细胞蛋白质,应用western blot方法检测ARHGEF10L蛋白表达以确定ARHGEF10L干扰效率。同时在SGC7901细胞中进行Cell Counting Kit-8实验、Transwell实验以及血管形成实验,分析研究抑制ARHGEF10L蛋白表达对胃癌细胞增殖、迁移、血管形成能力的影响,并进行统计学分析。4、在胃癌细胞系SGC7901中,分别干扰或者过表达ARHGEF10L,72小时后收集细胞蛋白,采用western blot方法检测上皮细胞标记蛋白（E-cadherin）和间质细胞标记蛋白（N-cadherin、Slug）表达情况,分析研究ARHGEF10L对胃癌上皮间质转化（EMT）的作用,并进行统计学分析。5、在胃癌细胞系SGC7901中分别转染对照组质粒（pcDNA3.1-RFP）和过表达 ARHGEF10L 质粒（pcDNA3.1-ARHGEF10L-RFP）,应用 Rho Activation Assay Kit试剂盒检测GTP-RhoA蛋白表达情况,同时检测下游相关ROCK1、pERM蛋白表达水平,分析研究过表达ARHGEF10L蛋白对RhoA信号通路的作用,并进行统计学分析。6、在胃癌细胞系SGC7901中分别转染对照组质粒（pcDNA3.1-RFP）和过表达ARHGEF10L质粒（pcDNA3.1-ARHGEF10L-RFP）,转染48小时后收集细胞,提取RNA进行RNA-sequencing分析（上海欧易生物公司）,分析研究ARHGEF10L可能参与的下游信号通路。研究结果1、在癌旁组织相比,在胃癌组织中ARHGEF10L蛋白表达水平高于癌旁组织,并且差异有统计学意义。2、胃癌细胞系SGC7901中,转染过表达质粒（pcDNA3.1-ARHGEF10L-RFP）,可以成功增加ARHGEF10L蛋白表达。CCK-8实验证明与对照组相比,过表达ARHGEF10L蛋白可以增强胃癌细胞增殖能力;Transwell实验证明与对照组相比,过表达ARHGEF10L蛋白可以增强胃癌细胞迁移能力;血管形成实验证明,过表达ARHGEF10L蛋白后胃癌细胞血管形成增多,并且均有统计学差异。3、在胃癌细胞系SGC7901中,转染ARHGEF10L小干扰RNA（Anti-ARHGEF10L siRNA）可以成功抑制ARHGEF10L蛋白表达,差异有统计学意义。CCK-8实验证明与对照组相比,抑制ARHGEF10L蛋白表达可以降低胃癌细胞增殖能力;Transwell实验证明与对照组相比,抑制ARHGEF10L蛋白表达可以降低胃癌细胞迁移能力;血管形成实验证明抑制ARHGEF10L蛋白表达后胃癌细胞血管形成减少,差异均有统计学意义。4、胃癌细胞系SGC7901中,western blot结果证明,过表达ARHGEF10L可以降低上皮细胞标记蛋白E-cadherin表达,同时增加间质细胞标记蛋白N-cadherin、Slug表达,差异有统计学意义。相反,抑制ARHGEF10L蛋白表达可以增加上皮细胞标记蛋白E-cadherin表达,同时降低间质细胞标记蛋白N-cadherin、Slug表达,差异有统计学意义。5、在胃癌细胞系SGC7901中,过表达ARHGEF10L蛋白促进GTP-RhoA、ROCK1、pERM蛋白表达,差异有统计学意义。6、胃癌细胞系SGC7901中,RNA-sequencing分析提示过表达ARHGEF10L蛋白促进HSPA6蛋白表达,差异有统计学意义。结论1、ARHGEF10L蛋白在胃癌组织中表达水平升高,提示其可能与胃癌致病过程密切相关。2、Cell Counting Kit-8实验、Transwell实验和血管形成实验提示过表达ARHGEF10L蛋白可以增加胃癌细胞增殖、迁移以及血管形成能力,相反,抑制ARHGEF10L蛋白表达可以降低胃癌细胞增殖、迁移以及血管形成能力。3、在胃癌细胞中,过表达ARHGEF10L可以降低E-cadherin蛋白水平,同时提高N-cadherin和Slug蛋白水平,从而诱导胃癌上皮间质转化的发生,进一步促进胃癌的致病过程。4、在胃癌细胞中,过表达ARHGEF10L蛋白可以通过促进GTP-RhoA-ROCK1-pERM信号通路从而参与胃癌的致病过程。另外,过表达ARHGEF10L蛋白提高HSPA6蛋白表达。