研究背景及目的：疟原虫属于真球虫目,血孢子虫亚目,疟原虫科,寄生于人体可以引起人类疟疾。尤其是恶性疟原虫(Plasmodium falciparum),与75%的人类疟疾有关[1],疟疾流行于102个国家和地区导致4亿人感染,虽然大多数患者能够治愈,可是仍有100万人死亡,其中以儿童占了多数。至今我国仍有约15个省(自治区)546个县(市)近3亿人口还在疟疾威胁之中,南部恶性疟病例增多,因此,疟疾的防治在传染性疾病中仍然居于重要地位[3]。以青蒿素为基础的联合疗法(ACT)是目前治疗恶性疟疾这一最致命的疾病形式最强有力的武器,其疗效能达到90%以上[4,5],但近年来科学家们发现少数恶性疟原虫对青蒿素、氯喹等药物表现出抗药性,在部分东南亚地区日益严重在柬埔寨和泰国边境地区近期已确认出现青蒿素耐药性,这为疟疾的防治工作敲响了警钟。开发抗疟疾新药不但至关重要而且面临着急迫性。为了找到新的抗疟药物作用靶标,我们须进一步研究疟原虫的结构及其特性,以找到有效的药物作用靶点,为研究抗疟新药提供基础。寄生虫体内许多特殊的细胞器是寄生虫特有的,是宿主体内不存在的,通过对这些细胞器的结构和功能的深入研究,就有可能发现针对这些寄生虫的特异靶标。近期研究发现并命名的一个新细胞器一酸性钙体(Acidocalcisome, Ac)就是其中之一。酸性钙体是一种特殊的细胞器,由美国伊利诺依大学Dr.Docampo Roberto教授的研究团队首先在锥虫体内发现,因其富含钙和磷酸盐,呈酸性,故命名为酸性钙体。随后又在利什曼原虫、弓形虫、疟原虫、艾美原虫、绿藻、霉菌、细菌、卵黄及人类血小板中均发现有该类细胞器的存在。相对于大家所熟知的细胞器,这种新近发现的细胞器为我们研究抗疟新药提供了更大可能性。研究发现,酸性钙体的膜上有许多泵：如钙泵(Ca2+-ATPase)、质子泵(Vacuolar-H+-ATPase, Vacuolar-H+-pryophosphatase)、钠/氢泵(Na+/H+ exchanger)、钙/氢泵(Ca2+/H+ exchanger)和水蛋白通道(Aquaporin)、离子通道等。其中,液泡型质子焦磷酸酶为酸性钙体所特有,已被应用为酸性钙体分离纯化及定位的标志。这些蛋白为酸性钙体的主要生理功能奠定了结构基础。酸性钙体的主要功能有4个：储存磷酸盐,储存阳离子,调节pH值和调节渗透压。这些成分对寄生虫的毒性、代谢和入侵宿主具有非常重要的作用。在对寄生虫酸性钙体的研究中,以锥虫和弓形虫的研究最为深入,疟原虫中也已证实有酸性钙体的存在[18-20],但对其研究远不如锥虫和弓形虫深入,其具体的结构、生物学功能和代谢特点尚未十分清楚。为了找到更多可作为抗疟新药靶标的蛋白,我们需要对恶性疟原虫酸性钙体进行蛋白质组学分析。研究方法与结果：用传统方法从恶性疟原虫中分离、纯化酸性钙体非常困难。因为恶性疟原虫体外培养时,其生长过程受血清影响很大,很难标准化,因此很难获得足够量的虫体。本课题组在长期的恶性疟原虫相关研究过程中,建立了利用AlbuMAXⅠ替代人血清培养恶性疟原虫的方法,体外连续培养红细胞感染率最高可以达到40%。该方法已证明能满足大规模分离、纯化虫体的需求,可提供充足的虫源。在红细胞感染率达到20%时,收集虫血,经60%的Percoll分离纯化感染红细胞后,用皂素室温条件下温和裂解红细胞,得到纯化的恶性疟原虫滋养体和裂殖体。细胞裂解液配合碳化硅碾磨裂解虫体之后,收集匀浆上清。本实验室在前期对伯氏疟原虫酸性钙体进行研究时,摸索出适合分离纯化伯氏疟原虫酸性钙体的碘克沙醇密度梯度为15%、20%、25%、30%、34%和38%,相对离心力30000g。我们将相对离心力调整为50000g后,发现该梯度同样适合恶性疟原虫酸性钙体的提取,离心管内溶液分为13层,酸性钙体被富集于最底层沉淀中。将最底层沉淀重悬后进行透射电镜观察,发现其中含有丰富的大小不等的圆形电子致密颗粒,对纯化的恶性疟原虫感染红细胞样本经制片处理后进行透射电镜观察,发现虫体中有散在分布的大小不等空泡或包涵体。这些均与前人文献报道相符,由此认为,本研究成功将恶性疟原虫酸性钙体提取纯化。将纯化的恶性疟原虫酸性钙体样品裂解、浓缩、电泳后,割胶进行液相色谱(LC-MS/MS)鉴定。通过Mascot2.3.02软件对鉴定得到的肽段进行分析比对,,我们共得到283个鉴定蛋白质,其中77个为假想蛋白质,62个为恶性疟原虫保守蛋白,144个为已识别蛋白质。对鉴定到的蛋白进行GO功能分析注释,我们发现,在分子功能(Molecular Function)分类结果中,催化活性蛋白(catalytic activity)和结合活性蛋白(binding activity)占绝大多数,分别为33.33%和55.56%；亚细胞定位(Cellular Component)结果显示,16.67%的鉴定蛋白质位于细胞器；参与生物进程(Biological Process)分类结果显示,16.47%鉴定蛋白质主要参与新陈代谢过程(metabolic process)、16.47%参与细胞过程(cellular process)、12.50%参与单一生物过程(single-organism　process)、将鉴定到的蛋白质和COG数据库进行比对,预测这些蛋白质大部分可能与能量生产及转换(Energ production and conversion)、细胞内交通、分泌及膜泡转运(Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport)和预测一般功能(General function prediction only)有关。这些特征与酸性钙体的四个主要功能相关。通过文献检索及生物学分析,最后初步预测液泡型质子焦磷酸酶(V-PPase)、磷酸核糖焦磷酸合成酶、磷酸化型Ca2+ATP酶、ATP结合转运体蛋白、小GTP结合蛋白sar1、钙依赖性蛋白激酶4 (CDPK4)、14-3-3蛋白家族、水甘油通道蛋白(AQP)、液泡型质子ATP酶、囊泡相关膜蛋白、磷脂转运ATP酶、液泡型ATP合成酶等17个蛋白质可能定位于恶性疟原虫酸性钙体。本实验室在对伯氏疟原虫酸性钙体蛋白质组学的研究中,初步预测了水通道蛋白、CCR4相关因子16、钙依赖性蛋白激酶4(CDPK4)、多重耐药蛋白(MRP)、液泡型ATP合成酶亚单位(a,b,c,h,f)、磷脂转运ATP酶、磷脂酰肌-3酶、磷脂酶A2 (PLA2s)和液泡型质子焦磷酸酶(V-PPase)等18个蛋白定位于酸性钙体。因伯氏疟原虫跟恶性疟原虫在形态结构、基因组成、生理特点、生长周期等方面非常相似,因此,伯氏疟原虫酸性钙体的蛋白质组学研究对于本实验具有一定的指导意义。通过将恶性疟原虫酸性钙体的17个预测蛋白和伯氏疟原虫酸性钙体的18个预测蛋白进行对比分析,我们发现了8个蛋白在恶性疟原虫和伯氏疟原虫酸性钙体中均被预测有存在的可能。通过用ClustalW2对这8个蛋白进行同源性比对,发现其中有7个蛋白同源性较高,大于60%。大量阅读相关文献并综合以上分析后,我们选择恶性疟原虫水甘油通道蛋白(PfAQP)作进一步的研究,同时我们需要恶性疟原虫液泡型质子焦磷酸酶(PfVP1)的抗体做共定位研究。因其二者跨膜区均较多,不易进行原核表达,多次尝试均以失败告终,故我们选择利用合成肽与载体蛋白偶联作抗原免疫小鼠的方法制备单克隆抗体。为了后续研究的开展,我们将弓形虫液泡型质子焦磷酸酶(TgVP1)的氨基酸序列与PfVP1作比对,选择其同源序列合成肽段制备单抗,PfAQP单抗制备则选择PfAQP与伯氏疟原虫水通道蛋白(PbAQP)的同源肽段进行合成。恶性疟原虫水通道蛋白(PfAQP)全长258个氨基酸,大小约为28kDa,弓形虫液泡型质子焦磷酸酶(TgVP1)全长816个氨基酸,大小约为85kDa。针对PfAQP,经过IEBD、BCPREDS Server 1.0、TMHMM Server v 2.0和同源性比对分析,我们在PfAQP的6个跨膜区之外选择了与恶性疟原虫和伯氏疟原虫同源性较高的肽段,CPLVDLANNEKDGVDL,位于肽链全长的C端243～258个氨基酸。用这种方法我们最终获得2C3和6H10两株单抗,这两株单抗不仅能与人工合成的多肽反应,而且可以识别天然恶性疟原虫蛋白中的27kDa大小蛋白,与PfAQP预测大小及文献报道相符[37]。而针对TgVPl,我们利用IEBD、TMHMM Server v 2.0和同源性比对分析后,选择了其17个跨膜区外并与疟原虫同源性较高的肽段,用这种方法我们最终获得单抗1D7-H11、3A6-E4和3G6-F9,这3株单抗均可以识别天然弓形虫全蛋白中85kDa大小和恶性疟原虫全蛋白中76kDa大小蛋白。进行免疫荧光鉴定时,以上5株单抗均能产生特异性荧光,但PfAQP与TgVPl的荧光能否共定位仍需进一步验证。结论：本研究建立了AlbuMAX I替代人血清体外连续培养恶性疟原虫的方法,收集到足够虫体,成功分离纯化出恶性疟原虫酸性钙体并进行了蛋白质组学分析,鉴定获得283个蛋白质,经系统生物信息学分析初步预测有17个蛋白质可能定位于恶性疟原虫酸性钙体,并成功制备了2株恶性疟原虫水甘油通道蛋白抗体和3株弓形虫液泡型质子焦磷酸酶抗体,经鉴定,这5株抗体均可与目的蛋白特异性结合,且抗弓形虫液泡型质子焦磷酸酶抗体可与恶性疟原虫液泡型质子焦磷酸酶特异性结合。以上实验结果为恶性疟原虫酸性钙体的相关研究及抗疟新药作用靶标的开发奠定了基础。