华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)又称肝吸虫(liver fluck)，其寄生在人体肝胆管内所引起的以肝胆病变为主的疾病称为华支睾吸虫病(clonorchiasis)，又称肝吸虫病。华支睾吸虫病广泛分布东南亚地区，我国是最主要的流行区。全球华支睾吸虫感染人数大约3500万，我国感染人数约1249万，其中广东省约500万。两次全国寄生虫病的调查结果显示华支睾吸虫感染率呈明显上升趋势。华支睾吸虫病是目前我国流行最严重的食源性寄生虫病。2005年，华支睾吸虫病被广东省政府列为重点防治的地方病。2006年，华支睾吸虫病被卫生部列为我国重点防治的寄生虫病之一。 华支睾吸虫病的正确诊断是防治的关键。目前华支睾吸虫病的诊断主要依靠病原学检查和免疫学检查。传统的病原学方法是镜检粪便中的虫卵，由于华支睾吸虫排卵具有周期性且虫卵很小，容易漏诊，且操作费时费力，不适合流行病学调查。免疫学诊断方法具有高度的敏感性和特异性，其中酶联免疫吸附试验(ELISA)操作简便，血样用量少，适合现场应用，是目前流行病调查中应用最为广泛的免疫诊断方法。 目前用于华支睾吸虫病免疫诊断的抗原主要是成虫粗抗原，但粗抗原制备困难，及检出的特异性和敏感性不是很理想，因此，应用基因工程技术合成重组抗原替代本课题由： 1.肝吸虫病普查试剂盒及确诊试剂盒的研制广州市科技计划项目(200623-E4011)基金资助 2.广州管圆线虫和华枝睾吸虫病关键防治技术的研究2006“863”专题(2006AA022422)基金资助粗抗原是免疫诊断试剂盒研制的必然趋势，关于华支睾吸虫免疫诊断抗原的筛选和评价是国内外华支睾吸虫病研究的重点。华支睾吸虫表膜脱落分子可以进入血液循环，刺激宿主产生抗体，而且与宿主肝胆管直接接触的虫体表膜抗原可以引起局部粘膜反应，因此表膜抗原在华支睾吸虫免疫、致病中有重要作用。本实验室前期通过间接ELISA方法评价6种华支睾吸虫重组蛋白的免疫诊断价值，发现华支睾吸虫成虫谷胱甘肽转移酶2(GST2)的特异性比较高，但敏感性仍不甚理想。随着基因工程技术的进展，可以根据需要对基因进行连接以提高重组抗原的诊断敏感性。为此，我们利用生物信息学技术，对本室构建的华支睾吸虫成虫cDNA文库进行筛选，从中挑选具有诊断价值的表膜蛋白基因，将其与GST2构建融合蛋白，并对融合蛋白的诊断价值进行初步验证，期望为华支睾吸虫病的诊断做出积极有益的探索。 研究目的： 识别、克隆华支睾吸虫成虫谷胱甘肽转移酶2(GST2)及表膜蛋白(TP22.3)，并将GST2和TP22.3共同克隆到pET—32a(+)载体上，构建融合蛋白。通过间接ELISA方法评价该融合蛋白检测华支睾吸虫病流行区的正常血清、感染血清中的IgG4亚类的敏感性和特异性，为华支睾吸虫免疫诊断抗原的筛选探索新的途径。 研究方法： 1.TP22.3基因的生物信息学分析 华支睾吸虫成虫cDNA质粒文库进行表达序列标签(expression sequence tag，EST)随机测序和unigene归并、拼接，获得多个华支睾吸虫成虫全长基因。用Specialized BLAST软件寻找目的序列的保守功能域，从大批华支睾吸虫cDNA序列中筛选出CsTP22.3的CDS。利用瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统站点提供的生物信息学工具分析预测CsTP22.3的理化特点、二级结构、拓扑结构及亚细胞定位等。 2.构建华支睾吸虫GST2和TP22.3融合蛋白 2.1 GST2基因的扩增、克隆 根据目的基因的ORF和原核表达质粒pET—32a(+)多克隆位点设计引物，利用聚合酶链反应(PCR)从华支睾吸虫成虫cDNA文库质粒中扩增出GST2的CDS。定向克隆该序列到质粒pET—32a(+)中，对重组质粒进行PCR、双酶切和测序鉴定。 2.2 TP22.3基因的扩增、克隆 根据目的基因的ORF和原核表达质粒pET—32a(+)多克隆位点设计引物，利用聚合酶链反应(PCR)从华支睾吸虫成虫cDNA文库质粒中扩增。定向克隆该序列到质粒pET—32a(+)—GST2中，对重组质粒进行PCR、双酶切和测序鉴定。 2.3融合蛋白的表达和纯化 将构建的重组质粒转化大肠杆菌BL21/DE3中，在IPTG诱导下表达融合蛋白，并经SDS—PAGE鉴定，重组蛋白包涵体经尿素变性后用亲和层析纯化。 3.间接ELISA法评价该融合蛋白与GST2检测IgG4亚类的敏感性和特异性 随机选取60份轻、中、重度感染的华支睾吸虫病人血清，20份健康人血清，20份不同感染度的日本血吸虫病人血清，间接ELISA法检测融合蛋白的诊断价值，并比较融合蛋白与GST2诊断的敏感性、特异性。 研究结果： 1.TP22.3基因的生物信息学分析 从UniGene中筛选出来的cDNA序列是CsTP22.3的CDS。该序列开放阅读框长573bp。CsTP22.3理论分子量为22.3KDa，pI为4.90，预测该蛋白在溶液中不稳定。CsTP22.3的二级结构组成中α螺旋占48.9％，β折叠占13.7％，无规卷曲占37.4％。CsTP22.3含有跨膜区，无信号肽序列。 2.构建华支睾吸虫GST2-CsTP22.3融合蛋白 分别设计引物从cDNA文库中扩增GST2和CsTP22.3目的片段，定向克隆GST2到pET—32a(+)上，经PCR、双酶切和测序鉴定后证实构建成功。定向克隆CsTP22.3序列到质粒pET—32a(+)—GST2中，对重组质粒进行PCR、双酶切和测序鉴定后，证实构建成功。重组质粒在IPTG诱导下表达重组蛋白，经SDS—PAGE显示与理论预测的融合蛋白分子量相符，表达产物经尿素变性、亲和层析纯化，获得目的蛋白。 3.间接ELISA法评价该融合蛋白与GST2检测IgG4亚类的敏感性和特异性 应用ELISA方法，分别以重组融合蛋白和GST2为检测抗原，检测60份不同感染度华支睾吸虫病人和20份正常人血清的IgG4，结果表明，融合蛋白诊断的敏感性和特异性分别为81.67％和85％，GST2诊断的敏感性和特异性为88.33％和90％。 研究结论： 1.生物信息学理论分析和实验确定了华支睾吸虫成虫cDNA质粒文库18d11号质粒中的插入序列即为华支睾吸虫CsTP22.3的CDS，预测其分子量为22.3kDa、等电点为4.90、溶液中不稳定、含动力蛋白轻链1功能域及具有钙结合功能的EF—hand功能域及跨膜区。 2.成功构建了pET—32a(+)—GST2-CsTP22.3原核表达载体，细菌培养物经过IPTG诱导表达出重组融合蛋白，纯化得到重组蛋白。 3.应用ELISA方法，比较重组抗原和成虫GST2检测华支睾吸虫病人血清IgG4敏感性表明，该重组蛋白诊断的敏感性和特异性均低于GST2。