论文部分内容阅读
目的:通过化学方法合成传统名贵中药石斛中的重要活性成分毛兰素，并分析其对人肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用及其细胞凋亡诱导作用。探讨毛兰素增殖抑制和诱导凋亡的作用机制。同时，通过The Binding Database结构检索和分子结构相似性检索，预测毛兰素可能的分子靶标，从而为毛兰素的临床前期研究奠定实验基础。 实验方法: 1.毛兰素的化学合成:以3，4，5-三甲氧基苯甲醛为原料经硼氢化和Michaelis反应和Arbusov重排反应得到3，4，5-三甲氧基苄溴三苯基膦盐。将上一步反应获得的3，4，5-三甲氧基苄溴三苯基膦盐与羟基保护的异香兰素经Wittig反应、硼氢还原、羟基脱保护，从而获得毛兰素纯品。 2.增殖抑制分析:不同浓度毛兰素给药肝癌细胞HepG2，分别通过使用MTT法及克隆形成抑制实验考察毛兰素对HepG2的增殖抑制作用。0.1％ DMSO做为对照组。 3.细胞周期时相分布:不同浓度毛兰素给药肝癌细胞HepG2，通过PI染色结合流式细胞术分析毛兰素对肝癌细胞HepG2细胞周期进程影响。 4.线粒体膜电位变化:不同浓度毛兰素给药肝癌细胞HepG2，采用线粒体膜电位特异性探针JC-1对线粒体膜染色，流式细胞术分析毛兰素对HepG2线粒体膜电位的影响。 5.Caspase活性分析:通过Caspase活性分析试剂盒，分析毛兰素对Caspase-3活性的影响。 6.细胞凋亡分子机制:通过蛋白质稳定性分析、shRNA技术、荧光素酶报告基因检测系统以及Western Blot技术确定毛兰素对HepG2细胞的增殖抑制作用及诱导细胞凋亡作用的分子机制。 7.JNK信号通路在毛兰素介导细胞凋亡过程中的重要作用:通过JNK小分子化学抑制剂SP600125、c-Jun的显性负突变TAM67以及shJNK等手段与方法，验证JNK信号通路在毛兰素诱导细胞凋亡中的作用。 8.毛兰素分子靶标预测:通过The Binding Database，对毛兰素分别进行子结构检索和分子结构相似性检索，预测毛兰素潜在的分子靶标。 实验结果: 1.毛兰素的合成:通过化学合成获得纯度较高的化合物，并且由核磁共振氢谱分析结构确认所得化合物确为毛兰素。 2.增殖抑制作用:与对照组比较，毛兰素能显著抑制人肝癌细胞HepG2等的增殖，随着毛兰素浓度的增加，作用时间的延长，毛兰素对细胞增殖抑制的作用更加显著，呈现出明显的剂量/时间依赖效应关系(18-80％，P＜0.05)。毛兰素对于HepG2细胞的IC50为11.4 nM(P＜0.05)，但是对于人正常肝上皮细胞HL-7702无明显增殖抑制作用，提示毛兰素可能对正常肝细胞具有较小的毒性。与此同时，克隆形成实验结果显示毛兰素也显著抑制肝癌细胞的增殖。 3.细胞周期时相分布影响:与对照组细胞相比，毛兰素显著诱导细胞周期G2/M阻滞(30-72％，P＜0.05)。 4.线粒体膜电位变化:毛兰素给药后，线粒体特异性探针JC-1红色聚集状态减少(76-22％，P＜0.05)，绿色单体状态增加(23-77％，P＜0.05)，表明毛兰素能够诱导HepG2细胞的线粒体膜电位下降，从而诱导细胞凋亡。 5.Caspase活性分析:检测结果表明，毛兰素给药24小时后能够明显增强HepG2细胞中Caspase-3的活性。 6.细胞凋亡分子机制:Western blot结果显示，毛兰素给药后，HepG2细胞中大部分Bcl-2家族的蛋白表达发生改变:其中，毛兰素上调促凋亡蛋白Puma，Bad, Bax，而下调抗凋亡蛋白Mcl-1，Bcl-2，Bcl-xl，荧光素酶报告基因检测系统结果显示，毛兰素能够显著提高Puma启动子活性从而促进Puma的转录。与此同时，细胞经蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)预处理后，毛兰素诱导的Mcl-1，Bcl-2下调现象更为明显，提示毛兰素可能抑制该蛋白质生物合成的稳定性。此外，通过RNAi技术敲除Mcl-1后，毛兰素的细胞增殖抑制效应则被大大削弱。 7.JNK信号通路在毛兰素介导细胞凋亡过程中的重要作用:Western blot表明毛兰素能显著诱导JNK Thr183/Tyr185位点的磷酸化，活化后的JNK能够诱导Bcl-2 Ser70位点发生磷酸化从而可能抑制其生物学活性。MTT实验表明，JNK小分子化学抑制剂SP600125能显著削弱毛兰素对肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用。 8.毛兰素分子靶标预测:通过The Binding Database数据库检索，发现有6个已知化合物与毛兰素结构类似，经归类统计分析，α/β-tubulin可能为毛兰素潜在的分子靶标。 结论: 1.化学合成得到纯度大于95％的毛兰素纯品，核磁共振进一步证实其化学结构。 2.毛兰素以时间/剂量依赖方式显著地抑制人肝癌细胞HepG2等的细胞增殖与克隆形成能力。同时毛兰素能诱导HepG2细胞周期阻滞在G2/M期。 3.毛兰素诱导HepG2细胞出现皱缩、核固缩与碎裂等典型细胞凋亡形态学特征。毛兰素通过下调肝癌HepG2细胞线粒体膜电位，改变Bcl-2家族促凋亡与抗凋亡蛋白的表达，触发Caspase级联反应，激活PAPR从而诱导细胞凋亡。 4.分子机制上，毛兰素上调Puma的蛋白表达，增强Puma启动子转录活性;与此同时，毛兰素降低Mcl-1，Bcl-2的蛋白质生物合成稳定性。此外，JNK/SAPK信号通路在毛兰素诱导的细胞凋亡过程发挥重要调控作用。 5.The Binding Database数据库预测，α/β-tubulin为毛兰素可能的分子靶标。