研究背景和目的:糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)作为糖尿病主要的微血管并发症之一,是成人致盲的主要原因。由于DR的发病机制非常复杂,尚未完全阐明,因此有必要了解其发病机制并寻找新的治疗靶点。DR的主要病理改变包括视网膜细胞凋亡和血管新生。以前的研究表明,DR的发展包括氧化应激、线粒体功能障碍、炎症等。近期研究表明,糖尿病还可以引起一些表观遗传方面的改变,包括DNA甲基化和组蛋白修饰,它存在于DR中。高迁移率族蛋白B1(HMGB1)是一种高度保守的非组蛋白DNA结合蛋白,在许多生物学行为中起着重要作用,HMGB1作为一种晚期炎症因子,在应激后能主动或被动地释放到细胞外液中。在细胞质中,HMGB1参与自噬和凋亡失衡。当释放时,HMGB1调节血管生成、细胞转移和炎性细胞因子的释放。最近的研究表明HMGB1与糖尿病周围神经病变有关,并参与DR的发生和发展,但其机制尚不清楚。NF-k B作为一个多功能核转录因子,在许多过程中体现了广泛的生物学活性,包括参与炎症反应,参与免疫应答,参与基因的表达和调控,参与细胞增生凋亡等主要的病理、生理过程。体内外实验研究证实,NF-k B的激活将导致炎症相关因子如IL-1,IL-6和TNF的表达增强,引起明显的炎症反应。近年来,NF-k B已成为各个医学领域的研究热点。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是一类催化超氧化物阴离子歧化反应的金属酶。在哺乳动物包括人类中,SOD有三种:SOD1(细胞内的Cu,Zn-SOD)、SOD2(线粒体中的Mn-SOD)和SOD3(细胞外液含Cu和Zn的EC-SOD)。SOD2的分布主要集中在真核生物和原核生物细胞的线粒体基质内,他可以清除线粒体内超氧阴离子,从而起到抗氧化应激的作用,因此被认为是可以抵御线粒体损伤的重要屏障之一。既往研究表明,体内SOD活性在炎症时下降,同时发现外源性SOD的给予可以起到终止炎症反应的作用。还有研究发现,用LPS刺激巨噬细胞,SOD活力的提升与NF-k B信号通路的阻断有关。另有研究表明,SOD2的基因多态性与糖尿病神经病变的产生显著相关,在糖尿病神经病变的体外细胞与在体动物模型中,过表达的SOD2也体现出保护作用。在糖尿病状态下,SOD2的活性呈现下降。陈锋等人观察到高糖下SOD2的蛋白合成可能受到一定程度抑制。表观遗传机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰和mi RNAs表达调控等,即在不改变DNA序列的情况下使基因的表达发生可遗传的改变。在糖尿病及其并发症的病理过程中,由高血糖为始发因素所引起的一系列病理和生理改变均可源自和导致多种表观遗传调节的异常。SOD2表观遗传调节涉及糖尿病视网膜病变发展以及其中的代谢记忆,糖尿病环境下SOD2启动子的H3K4me1和me2减少,组蛋白甲基化相关酶LSD1增多。LSD1的基因沉默可以减少SOD2启动子的H3K4甲基化,并阻断高糖对SOD2基因的下调作用。以上研究表明SOD2在DR中存在广泛的组蛋白修饰调节,而针对相关酶的操纵可以调控SOD2的表达,从而对DR起到表观治疗的作用。凋亡是由基因调控的细胞程序性死亡的过程,在诸多疾病中发挥关键作用。糖尿病视网膜病变的早期病理变化就是毛细血管内皮细胞和周细胞凋亡。凋亡细胞数目逐渐增多,部分毛细血管管壁通透性发生变化,进而形成无灌注区,毛细血管坏死闭塞。为了明确糖尿病视网膜病变中HMGB1和NF-k B、SOD2与LSD1的相关趋势,HMGB1与细胞增殖凋亡的关系本实验进行了深入的研究。研究方法:第一部分:HMGB1、NF-KB、SOD2、LSD1在正常和高糖环境下视网膜细胞中的表达构建糖尿病模型,体内糖尿病模型的建立通过向大鼠腹腔内注射链脲佐菌素,体外细胞模型的建立通过用高浓度葡萄糖培养基处理视网膜血管内皮细胞(HREC)。然后通过Western Blot、免疫组化、PCR等方法检测HMGB1、NF-k B、SOD2和、LSD1在体内外高糖环境下视网膜细胞中的表达。第二部分:HMGB1诱导NF-KB、SOD2与LSD1改变在视网膜细胞中的作用机制探讨构建糖尿病体内外模型方法同第一部分。体内部分:通过向糖尿病大鼠眼内玻璃体腔注射si RNA,使HMGB1沉默,通过向普通大鼠眼内玻璃体腔注射HMGB1,使HMGB1过表达。体外部分:通过对视网膜血管内皮细胞转染HMGB1-sh RNA,使HMGB1过表达。然后通过Western Blot、免疫组化、PCR等方法检测HMGB1、NF-k B、SOD2和、LSD1在体内外HMGB1改变后在视网膜细胞中的表达。Chip-seq检测HREC中HMGB1的结合位点并用Western Blot对其进行检测。第三部分:HMGB1对视网膜新生血管生成及视网膜细胞增殖凋亡的影响体内外造模方法同第二部分,ADP酶视网膜染色铺片用于检测视网膜新生血管情况。用cck-8法检测细胞增殖,同时经由流式细胞仪检测HREC的凋亡情况。结果:第一部分:HMGB1、NF-KB、SOD2与LSD1在正常和高糖环境下视网膜细胞中的表达糖尿病大鼠模型构建成功后,对照组和糖尿病组大鼠的体重和血糖随病程的延长逐渐出现差异,对照组大鼠体重高于糖尿病组,血糖均低于糖尿病组,并且具有有统计学差异(p<0.05)。体内Western blot实验从蛋白层面证实了糖尿病模型中HMGB1、NF-KB与LSD1的高表达与SOD2的低表达。视网膜切片免疫组化染色可见HMGB1、NF-KB的表达均在糖尿病模型呈增高的趋势(p<0.05)。同时体外实验中从细胞层面验证了HMGB1、NF-KB、SOD2与LSD1的表达(p<0.05)。我们将人视网膜血管内皮细胞(HREC),分别置于低糖及高糖条件下培养,发现HMGB1、NF-KB与LSD1在高糖培养基培养下,其表达增高(p<0.05),SOD2在高糖培养基培养下,其表达降低(p<0.05)。这与体内实验的结果相一致。第二部分:HMGB1诱导NF-KB、SOD2与LSD1改变在视网膜细胞中的作用机制探讨通过向糖尿病大鼠眼内玻璃体腔注射si RNA后经免疫组化、Western Blot检测,发现沉默HMGB1后,NF-KB与LSD1表达减少(p<0.05),SOD2表达增加(p<0.05)。通过向普通大鼠眼内玻璃体腔注射HMGB1后免疫组化、Western Blot检测,发现过表达HMGB1后,NF-KB与LSD1表达增加(p<0.05),SOD2表达减少(p<0.05)。这一结果说明HMGB1的表达的改变可以引起体内NF-KB、SOD2与LSD1表达的改变,这种改变同NF-KB、SOD2与LSD1在糖尿病模型中的改变相一致。对视网膜血管内皮细胞转染HMGB1-sh RNA,RT-PCR检测结果显示HMGB1-sh RNA转染可以引起HMGB1的过表达,经Western Blot与RT-PCR检测NF-KB、SOD2与LSD1的表达,发现过表达HMGB1后,NF-KB与LSD1表达增加(p<0.05),SOD2表达减少(p<0.05)。这与体内动物实验结果相符,从细胞水平进一步说明HMGB1引起NF-KB与LSD1的高表达与抑制SOD2的表达。通过Chip-seq,我们发现HMGB1结合位点在启动子区和TSS附近富集,这证实了HMGB1可能作为一种转录因子发挥作用。另外,Chip-Seq的结果中证实HMGB1可直接影响IKB-α的表达,从而影响NF-k B的表达。第三部分:HMGB1对视网膜新生血管生成及视网膜细胞增殖凋亡的影响通过ADP酶视网膜染色铺片,我们发现在糖尿病大鼠中视网膜新生血管较正常大鼠增多。正常大鼠HMGB1给予可以增加视网膜新生血管,而糖尿病大鼠si RNA给予可以减少新生血管(p<0.05)。体外实验用cck-8法检测细胞增殖,应用流式细胞仪检测HREC的凋亡情况。通过对HREC细胞转染HMGB1-sh RNA,使HMGB1过表达,发现HMGB1能够减少细胞的增殖同时增加细胞凋亡(p<0.05)。结论:大鼠视网膜组织和视网膜血管内皮细胞中NF-k B、LSD1表达与HMGB1呈正相关趋势,SOD2表达与HMGB1呈负相关趋势。HMGB1通过NF-KB与SOD2起作用可能是DR发生发展的机制之一。HMGB1促进视网膜新生血管的生成,抑制视网膜血管内皮细胞增殖同时促进视网膜血管内皮细胞的凋亡。HMGB1的抑制可能为糖网的治疗提供新的思路。