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线粒体是细胞的能量工厂,对细胞各种生命活动的维持具有不可替代的作用。钙离子作为细胞内的第二信使参与了一系列生命活动,线粒体内含有大量的钙离子,它们对氧化呼吸链具有重要的调控作用。正常情况下线粒体钙参与维持正常氧化呼吸,合成ATP,而病理刺激下,线粒体钙超载使得细胞氧化呼吸加强,产生过量的过氧化物,激活下游凋亡因子,破坏细胞膜结构,使得细胞凋亡。线粒体氧化呼吸受到细胞外不同刺激下引起的各种钙波的调控。脑缺血再灌注过程中也伴随着线粒体钙超载所产生的过量超氧化物引起的细胞死亡,因此线粒体钙稳态对细胞的生命活动尤为重要。线粒体钙摄取主要由线粒体钙单向转运体MCU调控,MCU通道的开放受到多种亚单位的调节,其中线粒体钙摄取蛋白MICU1直接与MCU结合,在调控钙离子内流入线粒体过程中起重要作用。M1CU1功能破坏直接影响线粒体钙稳态,导致脑、肌肉疾病,MICU1敲除导致新生鼠死亡、肝脏组织再生困难。我们之前通过酵母双杂交实验筛选到了与MICU1相互结合的去乙酰化蛋白SIRT1(基因沉默调节因子1),研究显示SIRT1在酵母,线虫中可以延长寿命,在动物体内也有延缓衰老延长寿命的作用。进一步的研究显示,SIRT1直接存在于线粒体参与细胞生命活动。因此SIRT1与线粒体关系及MICU1相关生物学功能成为我们关注的重点。为了探究SIRT1对线粒体的影响,我们首先运用细胞免疫荧光、Western blot方法检测出线粒体中存在SIRT1蛋白,并且SIRT1特异性抑制剂EX527能影响Hela细胞线粒体的形态,使得细胞内线粒体网络碎片化。然后,Rhod-2/AM染料或CMV-mito-R-GECO1质粒作为线粒体基质钙信号指示剂,分别用抑制剂影响SIRT1活性、shRNA影响SIRT1表达,并分别观察对线粒体钙摄取的影响,发现给予EX527能够显著增加组胺(10 μM和100 μM)刺激下线粒体的钙超载,无组胺刺激下基础钙信号与DMSO组相比并未有显著差异。转染shRNA干扰SIRT1发现高浓度组胺(100μM)刺激下,SIRT1干扰组钙信号显著增加,而无组胺刺激下基础钙信号也显著高于DMSO组。最后,结合前期酵母双杂交试验,并探究SIRT1对线粒体钙摄取影响是否通过MICU1起作用,我们先直接给予Hela细胞和SD鼠皮层神经元EX527处理,通过WB抗体检测,发现EX527并没有明显影响MICU1和MCU蛋白水平;抑制全细胞蛋白合成条件下,EX527也并未影响MICU1蛋白降解,实验中发现了 MICU1通过蛋白酶体途径降解。干扰SIRT1条件下WB结果显示,SIRT1蛋白降低,MICU1蛋白水平随之降低,而MCU蛋白水平仍保持不变。综上所述,我们可以得出结论:1、SIRT1直接分布于细胞线粒体上,并且能够影响细胞线粒体的形态。2、SIRT1参与到正常状态下线粒体钙信号的维持,EX527抑制SIRT1去乙酰化酶活性促进了细胞内线粒体钙离子在组胺刺激下的钙超载;干扰SIRT1同样促进高浓度组胺刺激下的线粒体钙超载,但增加了基础线粒体钙水平。SIRT1抑制剂与shRNA干扰SIRT1对MICU1、MCU蛋白水平的影响也并不完全一致,但两种途径均能影响线粒体钙超载。我们的发现揭示了 SIRT1定位于线粒体,并可能通过影响MICU1调节线粒体钙摄取这一生物过程的新机制,其具体途径和功能有待进一步探索,为寻找新的药物靶点提供方向。