论文部分内容阅读
【目的和背景】PD-1/PD-L1途径介导的负性调控信号能有效抑制机体T、B细胞功能,在机体免疫应答后期的负性调节中发挥了至关重要的作用。近来有报道称PD-L1的表达与EGFR的突变状态相关,但调控机制仍不明确。IL-6/JAK/STAT3为EGFR下游的一个重要信号传导途径,在促进肿瘤细胞增殖过程中起到重要作用,同时有报道转录因子STAT3可直接结合到PD-L1的启动子区,从而促进PD-L1的转录。本文旨在探究IL-6/JAK/STAT3信号通路作为EGFR下游途径是否与其调控PD-L1表达相关,并通过影响PD-L1的表达最终发挥影响细胞增殖的功能。【方法】(1)对肺腺癌细胞株HCC827、PC-9、H1975进行基因测序,明确其EGFR突变位点,并用CCK-8法检测细胞株对吉非替尼的IC50。(2)用RT-PCR及Western blot分别在mRNA及蛋白水平上检测EGFR野生型细胞株(H1299,SPC-A1,A549)和EGFR突变型细胞株(HCC827,PC-9,H1975)中PD-L1的表达。(3)选取HCC827和PC-9为研究对象,使用不同浓度EGF加以刺激,并用RT-PCR检测PD-L1的表达,选取最佳刺激浓度,用Western blot检测p-EGFR、PD-L1、p-STAT3及STAT3的表达。(4)用不同浓度的吉非替尼刺激细胞株,Western blot检测PD-L1、p-STAT3及STAT3的表达;(5)分别用含吉非替尼和含DMSO的培养基刺激HCC827及PC-9细胞株,收集不同时间段的细胞上清,用Elisa试剂盒检测IL-6的表达。(6)分别采用外源加入AG490及STAT3 siRNA干扰实验来阻断JAK/STAT3信号通路,用RT-PCR检测PD-L1的表达,Western blot检测PD-L1、p-STAT3及STAT3的表达。(7)应用siRNA干扰技术成功沉默PD-L1的表达后,采用CCK-8法及克隆形成实验检测细胞增殖、并流式细胞术检测细胞凋亡。【结果】(1)HCC827及PC-9为19号外显子缺失且对吉非替尼敏感的肺腺癌细胞株,而H1975为20号外显子T790M突变合并21号外显子L858R突变且对吉非替尼耐药的肺腺癌细胞株。(2)EGFR突变型胞株PD-L1的表达高于EGFR野生型细胞株。(3)用EGF刺激HCC827及PC-9细胞活化EGFR信号通路后,PD-L1表达上调,且伴随p-STAT3上调,STAT3无明显变化。(4)用吉非替尼刺激HCC827及PC-9细胞抑制EGFR信号通路后,PD-L1表达下调,p-STAT3表达下降,STAT3无明显变化。(5)在分别用含吉非替尼和含DMSO的培养基刺激HCC827及PC-9细胞株后,我们发现吉非替尼组的细胞上清IL-6含量虽然随着刺激时间的延长有所增加但是其总体上升趋势较DMSO组慢。(6)AG490抑制JAK/STAT3信号通路后下调了PD-L1的表达,而用STAT3 siRNA沉默STAT3表达后可达到同样的效果。(7)用PD-L1 si RNA沉默PD-L1表达后细胞增殖能力降低,凋亡增加。【小结】EGFR-TKI可以通过下调IL-6的分泌来阻断JAK/STAT3信号通路,进而调控STAT3表达,最终抑制PD-L1的表达,并通过PD-L1的表达变化影响细胞增殖功能。因此,EGFR-TKI不仅可以直接抑制肿瘤生长还可以通过抑制IL-6/JAK/STAT3信号通路下调PD-L1的表达来调节肿瘤免疫微环境,为肺癌的靶向治疗和免疫治疗相结合提供了实验依据和理论基础,其临床意义还有待进一步探究。