食品安全作为一个重大的世界性公共卫生问题,越来越受到人们的重视。在各类食品安全事件中,由细菌引起的食物中毒事件占有较大的比例,是引起食物中毒的重要因素之一。其中,沙门氏菌（Salmonella）、单增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）和小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）是3种典型的人畜共患病致病菌,它们能够污染多种食品。目前,国内检测食品中致病菌主要采用传统的分离、培养、生化鉴定的方法,其操作繁琐,检测时间较长,通常需要一周才能完成,且灵敏度较低,已经不能满足食品中致病菌快速灵敏检测的需要。与普通PCR有相同原理的多重PCR是一种快速、高效且高通量的检测方法,能同时检测多种食源性致病菌,节省成本和时间,该方法在致病菌检测领域有着广泛的应用前景。本研究根据沙门氏菌菌毛fimY基因、单增李斯特氏菌溶血素hlyA基因和小肠结肠炎耶尔森氏菌粘附侵袭位点ail基因设计了三对特异性引物,建立了同时检测三种食源性致病菌的多重PCR方法。根据影响多重PCR反应的因素,利用两个正交试验设计分别对多重PCR反应体系中的三对引物量添加比进行L9（33）正交优化和Taq酶、dNTPs、镁离子、混合引物的添加量进行L16（4⁴）正交优化,然后对退火温度和Buffer的反应浓度进行优化,最终确定多重PCR反应体系为25μL:3.8μL 10^×PCR buffer,1.5μL Mg²⁺（50 mmol/L）,3.0μL dNTPs（各2.5 mmol/L）,0.3μL Taq酶（5 U/μL）,沙门氏菌上下游引物1.0μL（10^μmol/L）,单增李斯特氏菌上下游引物1.5μL（10^μmol/L）,小肠结肠炎耶尔森氏菌上下游引物0.5μL（10^μmol/L）,模板各0.5μL,ddH20 8.9μL;反应程序为:94℃预变性5 min,94℃变性45 s,59.8℃退火45 s,72℃延伸45 s,进行30个循环,最后72℃延伸10 min。通过引物特异性和反应特异性试验,证明该方法具有较好的特异性。多重PCR扩增产物进行测序验证,并将测序结果在GenBank上进行在线BLAST比对,证实了扩增产物的确是目的基因的扩增且同源性均达到99%以上。为了比较多重PCR检测三种致病菌的特异性及灵敏度,建立单重PCR检测体系作为对照。在最佳实验条件下,多重PCR同时检测三种食源性致病菌纯培养物的灵敏度沙门氏菌为10² CFU/mL、单增李斯特氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌均为10³ CFU/mL;采用试剂盒法提取DNA,在人工污染猪肉品中同时检测三种食源性致病菌的检出限沙门氏菌为10³ CFU/g、单增李斯特氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌均为10⁴ CFU/g,其灵敏度和检出限均略低于单重PCR检测。人工污染猪肉样品经9 h富集培养增菌后,其检出限可达10⁰ CFU/g。对实际样品进行检测,并与国标法进行比较,证明该方法检测三种食源性致病菌具有较高的敏感性、特异性和符合率。本研究建立的多重PCR检测方法简单、快速、准确、灵敏度高、低成本、高通量,具有较强的实际应用价值,对控制病原微生物的传播,预防食物中毒的发生有着积极的意义。