渗透性开放血脑屏障促进神经生长因子透过的实验研究

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背景与目的:新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage HIBD)是新生儿常见的中枢神经系统弥漫性损伤。能量代谢障碍、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸的神经毒性、NO和氧自由基的损伤以及细胞凋亡等共同参与了HIBD的病理生理过程。神经生长因子(NGF)对神经元有营养和促进突起生长的双重作用,它对中枢及周围神经元的存活、分化、生长、再生和功能特性的表达均发挥重要作用,是参与损伤神经再生和功能修复的重要因素。动物实验表明,脑室注射NGF后,各脑区生长相关蛋白-43(GAP-43)免疫反应活性有所增强。GAP-43是神经组织特有的一种糖蛋白,对神经的生长、发育、再生以及突触功能的维持和递质的释放都起着重要作用。大量研究表明GAP-43在生长、分化的神经元纤维末梢含量极高,证明GAP-43与神经纤维的生长、再生和分化密切相关。然而,由于NGF属大分子蛋白质,正常情况下难以通过血脑屏障(blood brain barrier BBB),目前临床上缺乏一条合理有效的NGF中枢给药途径。构成屏障的主要是脑毛细血管内皮细胞(BMECs),在高渗透压的作用下,脑血管内皮细胞的紧密连接能被可逆性的打开,这种开放可以让水溶性药物、蛋白质和其他溶剂进入脑。动物实验已证实颈动脉灌注高渗溶液可使BBB开放。实验证明远端静脉注射甘露醇也可以暂时渗透性开放BBB,渗透的方法已成功的在实验和临床上被用于脑肿瘤等的治疗。本课题旨在从动物实验角度初步探讨远端静脉输注甘露醇后NGF通过BBB进入中枢神经系统的量的变化情况,并研究外源性NGF对HIBD大鼠脑组织内GAP-43表达的影响,为临床治疗提供依据。材料与方法:1.模型的制作和分组7日龄新生大鼠100只分为两部分:第一部分随机分为NGF治疗组(Ⅰ)、模型对照组(Ⅱ)和假手术组(Ⅲ)各20只。Ⅰ、Ⅱ组经标号称重乙醚吸入麻醉后置于手术板上,仰卧位固定头部及四肢,消毒后取颈正中切口,游离左颈总动脉,用丝线结扎,缝合切口,放回窝中休息1小时后,置于缺氧箱中,通入氮氧混合气体(8%O2+92%N2)2小时,制成大鼠HIBD模型。假手术组仅分离出左侧颈总动脉,不结扎亦不缺氧,饲养方式同Ⅰ、Ⅱ组。第二部分随机分为甘露醇+NGF治疗组(ⅰ)、单纯NGF治疗组(ⅱ)、模型对照组(ⅲ)、假手术组(ⅳ)各10只,ⅰ、ⅱ、ⅲ组同第一部分Ⅰ、Ⅱ组方法制作HIBD模型,ⅳ组同第一部分Ⅲ组。2.药物应用和标本采集第一部分NGF治疗组在大鼠缺氧缺血后即刻腹腔注射NGF 100U(5000~7000U/kg),以后每天1次,连续7天;模型对照组缺氧缺血后即刻腹腔注射生理盐水,注射量及时间与治疗组相同;假手术组不注射任何试剂。从各组中分别随机选择10只新生鼠,均于观察第8天处死,心脏灌注后迅速将脑解剖分离,固定,常规脱水,石蜡包埋,作连续冠状切片备用;第二部分大鼠缺氧缺血24小时后,ⅰ组快速静脉窦推注20%甘露醇1.5g/kg后10min再推注NGF100U,ⅱ组直接静脉推注NGF100U,各组动物分别于用药后30分钟处死,分离脑组织,制成组织匀浆备用;ⅲ、ⅳ组不用药直接处死取脑组织制作组织匀浆备用。3.指标观察第一部分组织切片分别做HE染色和免疫组织化学染色观察病理学变化与GAP-43表达情况,第一部分各组剩余大鼠于手术后第28天行迷宫实验测试,观察大鼠的学习及记忆能力。第二部分脑组织匀浆用酶联免疫吸附(ELISA)法测定NGF含量。4.统计学分析用SPSS11.0软件系统分析结果,计量资料以均数±标准差((?)±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.一般资料各组大鼠体重、麻醉时间、手术时间差异均无显著性(P>0.05)。2.病理变化镜下观察结果,主要观察大脑皮质、纹状体、海马和丘脑等部位。假手术组无明显病理改变。模型组镜下可见到神经细胞的变性坏死。而治疗组病理改变较轻。3.GAP-43表达情况Ⅲ组各脑区GAP-43阳性区平均灰度值高于Ⅱ组(P<0.05),Ⅰ组GAP-43阳性区平均灰度值明显高于Ⅱ组(P<0.05)和Ⅲ组(P<0.05)。4.NGF对大鼠的分辨学习能力与记忆保持能力的影响Ⅱ大鼠第1天和第2天达标所需反应次数都明显多于Ⅲ组(P<0.05)和Ⅰ组(P<0.05),正确反应率也都明显低于Ⅲ组(P<0.05)和Ⅰ组(P<0.05)。不过,Ⅰ组第1天和第2天达标所需反应次数仍都明显多于Ⅲ组(P<0.05),正确反应率也仍都明显低于Ⅲ组(P<0.05)。5.脑组织匀浆中NGF的水平ⅰ组脑组织匀浆中NGF水平明显高于ⅱ组(P<0.05)、ⅲ组(P<0.05)与ⅳ组(P<0.05):ⅱ组脑组织匀浆中NGF水平明显高于ⅲ组(P<0.05)与ⅳ组(P<0.05);ⅲ、ⅳ组各组间脑组织匀浆中NGF水平差异无显著性(P>0.05)。结论1.NGF对大鼠缺氧缺血性脑损伤有保护作用;2.外源性NGF后可增加脑组织内GAP-43的表达,并可明显改善HIBD大鼠的学习和记忆能力;3.静脉应用甘露醇渗透性开放血脑屏障可以显著增加NGF透过大鼠血脑屏障的量。
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