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第一部分人髓核组织中差异性表达mi RNAs的筛选及mi R-21的高表达验证目的:为探索mi RNA(mi RNAs)在椎间盘退变发病机制中的作用,检测人髓核组织mi RNAs表达谱,筛选出差异性表达的mi RNAs,并在人退变的髓核组织中进行验证。方法:分别选取5例正常髓核组织样本和5例退变髓核组织样本,利用Sure Print Human mi RNA Microarrays(V16.0)检测各髓核样本中mi RNAs表达谱,筛选差异性表达的mi RNAs。利用q RT-PCR技术对差异性高表达的mi R-21在48例不同Pfirrmann分级的髓核组织中进行验证。结果:1、本实验成功获得人退变髓核组织差异性表达的mi RNAs表达谱,筛选出20种明显上调(Fold change>2.0)的mi RNAs,9种明显下调(Fold change<0.5)的mi RNAs,其中差异有统计学意义(P<0.01)的有4种上调mi RNAs:has-mi R-21、has-mi R-122a、has-mi R-210、has-mi R-30-5p,2种下调mi RNAs:has-mi R-212-5p、has-mi R-33a。2、q RT-PCR结果显示在人退变的NP组织中,mi R-21的表达水平随Pfirrmann分级增加而上调。小结:mi R-21在退变的髓核组织中呈高表达,并与髓核组织退变等级呈正相关,提示mi R-21可能参与椎间盘退变的病理进程。第二部分Mi R-21靶向沉默PTEN抑制人退变髓核细胞自噬目的:探讨PI3K/Akt/m TOR信号通路在mi R-21靶向调控PTEN抑制髓核细胞自噬机制中的作用。方法:用生物信息学软件验证mi R-21与PTEN靶向结合情况。分离培养人退变髓核细胞后予以不同的处理,利用q RT-PCR、Western blot技术检测mi R-21对靶基因PTEN m RNA、蛋白的影响;运用MDC(单丹磺酰戊二胺)荧光染色法和Western blot技术检测mi R-21对自噬泡及自噬相关蛋白的影响;加入LY249002(PI3K/Akt的抑制剂)和Rapamycin(m TOR的抑制剂)后,应用Western blot或q RT-PCR技术检测靶基因及其下游各调控因子的蛋白和(或)m RNA表达水平。结果:多种生物信息学软件证实mi R-21与PTEN 3’-UTR有较好的结合位点及较低的自由能。q RT-PCR检测PTEN m RNA水平发现,mi R-21对各组PTEN m RNA的表达水平无明显差异(P>0.05),而Western blot检测PTEN蛋白水平发现,mi R-21 mimic能明显下调PTEN蛋白水平,mi R-21 inhibitor则出现相反结果(P<0.05)。MDC荧光染色结果显示与对照组相比,mi R-21 inhibitor可显著促进自噬泡的形成,而mi R-21 mimic组几乎观察不到自噬泡形成(P<0.05)。Western blot检测到PTEN蛋白表达水平不受LY249002和Rapamycin的影响(P>0.05);PTEN被mi R-21 mimic下调时,PI3K、Akt、m TOR、P62蛋白水平均明显上调,而LC3-II/LC3-I降低(P<0.05);其中,m TOR、P62和LC3-II/LC3-I的蛋白效应变化可被LY249002和Rapamycin所逆转(P<0.05),并且q RT-PCR检测P62/SQSTMI、LC3m RNA水平也证实了这一点。小结:1)PTEN是mi R-21的靶基因;2)mi R-21可通过靶向沉默PTEN,使PI3K/Akt/m TOR信号通路激活,抑制人退变髓核细胞自噬水平。结论:1)在人退变的髓核组织中,mi R-21呈高表达;2)在人退变的髓核细胞中,过表达的mi R-21可通过靶向沉默PTEN,激活PI3K/Akt/m TOR信号通路,进而抑制人退变髓核细胞自噬水平。