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本实验通过贴壁筛选法分离培养牛骨髓间充质干细胞(BMSCs),对分离培养的牛MSCs生物学特性进行了分析,并以牛MSCs为供核细胞进行了核移植实验,研究了牛MSCs核移植重构胚的体外发育能力,同时还对比研究了不同种类供体核的核移植重构胚在囊胚细胞数上的差异。最后进行胚胎移植,探讨了不同供体细胞对牛核移植重构胚移植后妊娠率的影响。实验取得以下结果:
1、经纯化培养后的牛MSCs形态均一,呈成纤维表型克隆样生长,瑞氏-吉姆萨染色可见细胞核较大,多为卵圆形,核仁明显,大多数细胞有2-4个核仁。碱性磷酸酶(AKP)染色,可见细胞呈弱阳性,说明分离得到的MSCs是一群比较原始的细胞。
2、分别用切割法和抽吸法来获取卵母细胞,切割法所收集的可用卵母细胞数显著多于抽吸法(P<0.05),培养后卵母细胞成熟率低于抽吸法但差异不显著。
3、牛卵母细胞成熟液中分别添加FSH(10μg/L)、ITS(10μl/mL)、EGF(10μg/L),配成3种不同体外成熟液分别对卵母细胞进行培养,FSH组第一极体排出率84.2%高于ITS和EGF组,差异显著。ITS组第一极体排出率75.9%高于EGF组70.2%,但差异不显著。
4、分别以牛MSCs,MCs,MECs为供体核进行核移植,MSCs组桑葚胚率(50.4±1.2%)高于MCs组(42.7±0.6%)(P>0.05)和MECs组(32.1±0.9%)(P<0.05),囊胚率(37.2±0.4%)显著高于MCs组(21.1±0.8%)和MECs组(20.4±0.6%)(P<0.05)。
5、对比三种供体细胞的核移植囊胚细胞数,MSCs组核移植重构胚平均细胞数(103±1.7)高于MCs组(87±2.4)和MECs组(76±3.2),接近超排胚胎(对照组)的细胞数(112±4.8)。
6、对不同供体核的核移植囊胚进行胚胎移植,胚胎移植后的MSCs组胚胎在妊娠的30~90天妊娠率高于MCs组和MECs组,差异显著。
本研究结果显示:牛MSCs增殖能力强,生物学性状稳定,易于分离纯化,短时间可扩增得到大量高纯度的MSCs,牛MSCs支持核移植胚胎的发育,与MCs和MECs核移植胚胎相比,牛MSCs重构胚的桑葚胚率、囊胚率都得到提高,胚胎移植妊娠率显著高于MCs和MECs组克隆胚胎。牛MSCs是一种较理想的牛核移植供体细胞。