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目的:通过悬浮培养技术体外分离培养SD大鼠胚胎神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs),并转染pc DNA-EGFP与pc DNA-EGFP-VEGF165质粒;探究超低温冻存对鼠胎膜生物活性的相关指标的影响;构建大鼠坐骨神经V度损伤模型以寻找更佳手术缝合时机,为后续移植治疗大鼠坐骨神经损伤提供实验基础和理论依据。方法:(1)以孕12.5d SD胚胎鼠端脑为组织来源,应用无血清悬浮培养技术进行分离培养、扩增NSCs;应用Nestin细胞免疫荧光技术检测NSCs特性;Brd U标记法检测NSCs增殖能力;使用细胞免疫荧光技术对诱导分化后的NSCs进行神经元特异性烯醇化酶(Neuron Specific Enolase,NSE)、胶质纤维酸性蛋白(Glia Fibrillary Acidic Protein,GFAP)鉴定;以HE染色、扫描电镜观察NSCs球及单细胞表面形态;经鉴定后的细胞分为三组:对照组、空质粒组、质粒组;使用梭华转染试剂盒,空质粒组转染pc DNA-EGFP质粒,质粒组转染pc DNA-EGFP-VEGF165质粒,24h后添加氨苄青霉素筛选,而对照组不进行转染和筛选;转染后第5d,质粒组提取VEGF165质粒进行基因测序;各组提取VEGF m RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,RT-PCR检测VEGF m RNA的相对表达量;并用流式细胞术检测质粒组NSCs的Nestin表达。(2)从孕12.5d SD大鼠获得胎膜组织,随机分为未处理组、冻存组、未冻存组;未处理组立即常规处理备用,冻存组则使用冻存液快速冻存于液氮罐中30d后处理,未冻存组冰上放置1h后再进行处理;各组胎膜以HE染色观察组织学改变,台盼蓝染色统计细胞死亡率,原位杂交检测VEGF m RNA和BDNF m RNA表达;Western Blot检测VEGF蛋白表达。(3)将42只成年SD大鼠随机分为7组,每组6只,模型组完全离断右侧坐骨神经股骨段,并于不同的时间点进行缝合;对各组坐骨神经损伤部分别在7d、14d、21d、28d取材,以HE染色、透射电镜、免疫组化、Western Blot、TUNEL检测法检测相关指标,分析术后愈合效果。结果:(1)培养出的神经干细胞球悬浮生长,阳性表达Nestin与Brd U;经诱导分化后的神经球阳性表达NSE、GFAP;HE染色可见神经球由大量的NSCs单细胞聚集而成,且单个的NSCs细胞核巨大,胞质较少;扫描电镜可观察到神经球表面的NSCs之间连接较疏散,单个NSCs胞体呈圆形,表面较光滑且无明显轴突生长;经转染24h后,仅少量单个NSCs表达绿色荧光;经氨苄青霉素筛选后的第5d和第7d可观察到大量神经球表达绿色荧光;质粒组提取的VEGF165质粒经测序后与Gen Bank收录的VEGF165基因编码区核酸序列(AF486837.1)完全一致;琼脂糖凝胶电泳结果显示,各组提取的VEGF m RNA完整性良好;RT-PCR结果表明无引物二聚体与特异性产物,2-ΔΔCT法进行数据处理分析,质粒组与空质粒组、NSCs组相比较,P<0.05;流式细胞术检测经质粒转染第5d的NSCs,阳性表达Nestin。(2)HE染色与台盼蓝染色:冻存组与未处理组相比,胎膜的组织形态改变及细胞的死亡率差异不明显;原位杂交与Western Blot检测:冻存组VEGF m RNA、BDNF m RNA阳性细胞数及VEGF蛋白的相对表达量均高于未处理组,P<0.05。(3)HE染色、透射电镜及TUNEL检测:6h缝合组与其他模型组相比较,坐骨神经形态学变异程度较小且凋亡细胞数少;免疫组化和Western Blot:VEGF蛋白在未缝合组和6h缝合组损伤早期(7d时)表达高于其他模型组(P<0.05)。结论:(1)应用无血清培养技术,体外培养扩增出的胚胎NSCs具有自我更新和多向分化能力;经质粒转染后可高表达基因产物,且对NSCs特性无明显影响。(2)经冻存液冻存的胎膜组织具有良好的生物活性。(3)坐骨神经损6h缝合组的修复效果优于其他时间缝组,其机制可能与VEGF蛋白表达增高有关。