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研究目的：阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种以进行性认知障碍和神经突触损伤为主要特征的神经退行性疾病,以Aβ淀粉样蛋白聚集和tau蛋白异常磷酸化形成的神经原纤维缠结作为主要病理特征,AD早期出现学习和记忆能力的下降与神经突触受损有直接相关性,其中,与AD病因学密切相关的Aβ升高经研究证实可促进Rock通路的表达作用增强,出现神经突触的抑制作用,同时,Rho/ROCK通路兴奋也能反向引起Aβ的异常集聚。因此,我们考虑ROCK通路作为药物的靶点研究其作用机制。中药石菖蒲化湿和胃,宁神益志,其性辛开苦燥温通,芳香走窜,具开窍醒神之功,且兼化湿,豁痰,辟秽之效,常辅佐其他药物以加强祛痰化湿之功。在前期研究中,我们发现石菖蒲有效成分中β-细辛醚对AD神经突触损伤有保护作用,对A β42的异常集聚抑制作用不明显,同时,研究结果发现可能与ROCK表达有关,但其具体机制仍不明确。因此,本研究通过建立AD动物和细胞模型,探索β-细辛醚靶向ROCK通路对AD神经突触的保护作用的分子机制研究。研究方法：1.选用5月龄APP/PS1小鼠作为AD动物模型进行实验研究,野生型小鼠作为空白对照组,采用Morris水迷宫检测小鼠行为学变化,用高尔基银染,刚果红染色从形态学上观察小鼠大脑中海马突触损伤和皮质部位β淀粉样蛋白的沉淀情况,观察β-细辛醚对小鼠行为学的影响和病理形态学上的作用；采用Western blot法检测突触相关蛋白突触素Synapsin 1 (SYN1)和突触后密度蛋白95抗体(PSD95)在APP/PS1小鼠海马中的表达情况,观察β-细辛醚对神经突触的保护作用；检测ROCK通路相关蛋白(ROCK2, LIMK1)的表达情况,观察β-细辛醚对ROCK通路的作用。2.采用miRNA基因芯片技术,对APP/PS1小鼠海马中miRNA进行高通量筛选,并经qRT-PCR实验进行有效验证,观察β-细辛醚对APP/PS1小鼠海马组织中特异性表达miRNA的影响,考虑是否存在与ROCK通路等相关表达的miRNA。3.通过构建ROCK2启动子双荧光素酶报告基因转染PC12细胞,用A β 25-35作为处理因素,观察β-细辛醚对ROCK2启动子转录活性的作用。4.采用免疫荧光和Western blot法检测神经生长相关蛋白Growth Associated Protein-43 (GAP43),突触素SYN1和Rho相关蛋白激酶2抗体(ROCK2)在AD细胞模型中的表达情况,观察β-细辛醚对AD细胞模型的保护作用和对ROCK2的表达影响。5.通过ROCK2-siRNA和ROCK2-overexpression质粒转染AD细胞模型,观察β-细辛醚依赖ROCK2的药效作用。6.构律特异性表达miRNA的模拟物和抑制物(如miR-335),并经生物信息学预测后进行WB功能性验证,再次通过构建ROCK2-3’UTR区含miR-335的结合位点的双荧光素酶报告基因确定miRNA的功能。研究结果：1.β-细辛醚能有效改善5月龄APP/PS1小鼠的空间学习和记忆能力。2.β-细辛醚能阻止突触相关蛋白SYN1和PSD95在APP/PS1小鼠海马组织中的丢失,同时能有效抑制ROCK2和LIMK1蛋白的表达。3.经miRNA基因芯片初步筛选,与APP/PS1小鼠相比,β-细辛醚组存在上调miRNA60个,下调53个；再经qRT-PCR检测后,与野生型小鼠作为参照,APP/PS1小鼠中miRNA表达下调的为miR-335,表达上调的为miR-574和miR-711,而β-细辛醚处理后能有效改善其miRNA水平,其中,经生物信息学预测miR-335, miR-574和miR-711分别与ROCK2,转化神经突起蛋白抗体neuritin (Nrnl)和p21激活激酶2抗体(PAK2)的mRNA有结合位点。4.β-细辛醚能有效抑制A β 25-35诱导的ROCK2启动子转录活性的升高。5.β-细辛醚能增强A β 25-35诱导的PC12细胞和原代海马神经元中SYN1和GAP43蛋白的表达,降低ROCK2的表达,同时经转染ROCK2-siRNA和ROCK2-over expression质粒后,β-细辛醚在沉默ROCK2后PC12细胞中SYN1表达无明显变化,而过表达ROCK2的情况下,β-细辛醚对Aβ 25-35诱导PC12细胞中的SYN1表达明显改变。6.β-细辛醚阻止miR-335下降,抑制ROCK2表达。研究结论：β-细辛醚通过抑制ROCK表达对AD神经突触抗损伤作用,同时亦能阻止miR-335下降,增强ROCK翻译水平的抑制作用。