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研究目的多糖是一类重要大分子物质,具有多方面的药理学活性,其作用主要包括:免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、降血脂、抗病毒、降血压、降血糖、增强骨髓造血机能等等。多糖的这些良好的药理活性,以及几乎无毒性的优点,愈来愈引起国内外生物化学家、药理学家的兴趣。研究发现:从香菇(Lentinue edodes)分离的β-葡聚糖LNT-S、从酿酒酵母(S.cerevisiae)分离的β-葡聚糖BBG均能抑制LPS诱导的炎症因子NO, TNF-α,IL-1等的表达。这种抑制作用是通过抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路的ERK1 / 2和JNK1 / 2的磷酸化而实现的。除了这两种β-葡聚糖外,是否还有其它具有α或者β-葡聚糖结构的多糖具有类似的生物学功能?是否所有D-葡聚糖结构的多糖均具有这种生物学活性?换言之,这种构效关系是否具有通用性?解决这些问题需要选择更多的含葡聚糖结构的多糖去验证和研究。本课题是在我们实验室前期工作的基础上开展,主要对2种以D-葡聚糖为主链的多糖的免疫调节作用及相关分子机制进行研究。一种是来源于甘蓝黑腐病黄单胞菌(Xanthomonas camperstris)细菌胞外杂多糖黄原胶(xanthan gum,XG ),另一种是来源于贻贝(Mytilus coruscus)的均多糖(Mussel polysaccharide,MP-A),两者都属于以D-葡聚糖为主链的高分子多糖。前期研究结果表明XG治疗骨关节炎动物实验研究取得很好的效果,MP-A调血脂、抗炎功能的动物实验研究疗效较好,两者均无显著毒副作用,良好安全性和有效性预示着优良的成药性和开发前景。多糖的生物学活性与多糖的一级结构、高级结构和理化性质密切相关。XG和MP-A虽然来源不同,但与LNT-S和BBG相似的是它们的主链中也含有D-葡聚糖结构,XG是含β-D-葡聚糖主链结构的杂多糖,而MP-A是含α-D-葡聚糖结构的同多糖。它们是否与已报道的LNT-S和BBG具有相似的生物学活性和分子机制尚未可知,目前对于这两种多糖的免疫药效学活性尚缺乏相关的研究数据。因此,本文对这2种多糖的免疫药理学活性进行考察,试图确定其细胞外靶标受体和胞内的分子传导机制。主要通过研究XG对小鼠RAW264.7巨噬细胞的影响,考察其体外免疫调节活性,特别考察XG对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导活化的巨噬细胞的作用,确证其可能结合的受体,进一步通过多种技术手段胞内信号传导机制。通过研究MP-A对人THP-1巨噬细胞的影响,考察MP-A体外免疫调节作用,特别是MP-A对LPS诱导活化的THP-1细胞的作用,寻找和确证MP-A细胞表面受体,进而初步研究其胞内的信号传导机制。最后比较总结两种D-葡聚糖结构多糖XG和MP-A的免疫调节活性的特点及作用机制的异同,为活性多糖的构效关系研究提供更多的实验数据。研究方法1 XG体外免疫药理学效应研究首先我们以小鼠RAW264.7细胞作为体外实验体系,以LPS诱导的RAW264.7细胞作为炎症模型,采用Cell Counting Kit-8 (CCK-8)试剂盒检测测XG对其增殖或者毒性作用。主要试验方法包括:扫描电镜(scanning electron microscopy,SEM)观察XG对小鼠RAW264.7细胞形态的影响;流式细胞仪检测细胞吞噬FITC-dextran实验来分析其对巨噬细胞吞噬功能的影响;Griess试剂法测定RAW264.7细胞经XG作用后产生NO的水平变化;ELISA试剂盒测定XG对RAW264.7细胞分泌IL-1β、IL-6及TNF-α细胞因子的影响;荧光定量RT-PCR分析 XG 对 RAW264.7 细胞 iNOS、COX-2、IL-6、IL-1β 和 TNF-α 的 mRNA水平变化的影响;此外釆用Western blot实验考察了 XG对LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS、COX-2蛋白表达量的影响,并运用SPR技术分析XG与重组TLR4的结合情况。2 XG作用于TLR4胞内信号转导机制研究采用小鼠RAW264.7细胞系,研究XG对LPS活化的巨噬细胞胞内信号传导分子机制,包括:用透射电镜(transmission Electron Microscope,TEM)观察XG对RAW264.7胞内细胞超微结构的影响;用Griess试剂法测定用抗小鼠TLR4抗体共孵育RAW264.7细胞30分钟后经XG作用后产生NO的水平变化;机制研究采用Western blot实验检测XG对RAW264.7细胞中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)途径相关蛋白的表达以及免疫荧光检测核转录因子(nuclear factor-κ-gene binding,NF-κB)的核转运的影响,并运用SPR技术分析XG除了 TLR4外与已知的常见其它受体dectin-1和TLR2的结合情况。3MP-A作用于活化的THP-1巨噬细胞TLR4受体的药理学效应及机制的研究我们以人THP-1细胞作为体外实验体系,以LPS诱导的THP-1巨噬细胞作为炎症模型,采用CCK-8试剂盒检测测MP-A对其增殖或者毒性作用。主要试验方法包括:流式细胞仪检测THP-1细胞吞噬FITC-dextran实验来分析MP-A对巨噬细胞吞噬功能的影响;Griess试剂法测定THP-1细胞经MP-A作用后产生NO的水平变化;ELISA试剂盒测定MP-A对THP-1细胞分泌TNF-α和PGE2的影响;此外采用Western blot实验考察了 MP-A对LPS诱导的THP-1细胞iNOS、COX-2蛋白以及MAPKs和NF-κB途径相关蛋白表达的影响,同时用免疫荧光检测了 MP-A对NF-κB的核转运的影响,运用SPR技术分析MP-A与重组TLR4、dectin-1和TLR2的结合情况。研究结果实验证明,两者均具有免疫调节活性,能够下调活化的巨噬细胞中炎症因子的表达。我们通过使用表面离子共振技术(SPR)考察了2种多糖与细胞表面已知的受体Dectin-1, TLR4和TLR2的亲和力,并确证了 TLR4是介导这2种多糖的受体。1.体外实验表明XG和MP-A均具有免疫调节活性,能够下调LPS活化的炎症因子NO、TNF-α、白介素(IL)或前列腺素2 (PGE2)等的表达。同时XG和MP-A具有增强巨噬细胞吞噬FITC-dextin功能的作用,表现出一定的免疫原性。暗示了 XG和MP-A可能具有双向调控的作用,同时说明炎症因子和吞噬功能可能是由不同的机制引起。2.初步确定了 XG和MP-A均可并由胞外TLR4受体识别,通过调节下游的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的磷酸化与核转录因子NF-κB的活化和核移位等方式完成胞内信号传导而发挥药理学作用。3.XG和MP-A下调活化的巨噬细胞炎症因子,同时可以抑制TLR4通路中的MAPK和NF-κB相关蛋白,表现出较强的抗炎活性,可用于炎性疾病治疗药物的开发。我们认为XG和MP-A可通过与LPS竞争性结合TLR4蛋白,抑制了 TLR4下游胞内信号主要是MAPK通路中的ERK和JNK蛋白的磷酸化而发挥抗炎的功能。这与研究报道的另外两种β-葡聚糖LNT-S和BBG结果一致,暗示了 D-葡聚糖结构可能是其生物学活性的必需基团。创新性和结论1.本文我们首次研究了 XG和MP-A体外免疫调节活性,研究了它们对巨噬细胞炎症因子的表达,吞噬功能,以及胞内相关蛋白表达的影响。2.首次通过SPR技术研究了 XG和MP-A分别和常见受体dectin-1、TLR4和TLR2的亲和力。首次确证了这XG和MP-A细胞表面受体为TLR4。3.首次考察了 XG和MP-A通过TLR4受体的胞内信号传导途径,进一步证实二者是通过调节下游的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的磷酸化与核转录因子NF-κB的活化和核移位等方式完成胞内信号传导而发挥抗炎药效,为XG和MP-A用于治疗炎性疾病的提供新见解。