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目的： 为了更进一步研究白介素27的生物学功能，建立IL27和IL27-Fc融合蛋白的真核表达制备系统，构建pMH3-IL27和pMH3-IL27-Fc真核重组表达质粒，利用高“GC”含量的pMH3真核表达载体通过哺乳动物细胞CHO系统实现IL27和IL27-Fc融合蛋白的高效表达，制备融合蛋白并鉴定其生物学功能，为IL27抗肿瘤作用的研究及对自身免疫性疾病治疗的临床前研究奠定坚实的基础。 方法： 1.人IL27亚基EBI3，p28及IgG1 Fc基因片段的克隆与扩增 抽取健康人外周血，采用Ficoll密度梯度离心法分离获得人外周血单个核细胞，加入GM-CSF和IL-4共同诱导，再利用脂多糖刺激后得到成熟的树突状细胞。Trizol法分别提取树突状细胞和外周血单个核细胞的总RNA，经逆转录和PCR扩增分别获得IL27亚基EBI3，p28基因和IgG1 Fc基因片段。 2.构建pMH3-IL27和pMH3-IL27-Fc重组表达质粒 IL27在体内是以异源二聚体的形式分泌的，在体外构建过程中我们用一段连接肽将EBI3和p28两个亚基连接起来，首先通过三条引物，将63个核苷酸片段连在EBI3基因的3端，再用重组PCR将连接有连接肽碱基片段的EBI3和p28亚基重组，得到完整IL27片段。再通过重组PCR将IL27与Fc片段重组，获得IL27-Fc融合基因。将IL27和IL27-Fc融合基因分别克隆至真核表达载体pMH3中，构建pMH3-IL27和pMH3-IL27-Fc重组表达质粒。 3.建立稳定高效表达IL27和IL27-Fc重组蛋白的CHO-S细胞株 通过电转染法将构建成功及测序正确的pMH3-IL27和pMH3-IL27-Fc重组表达质粒导入CHO-S细胞中，G418筛选，3轮单克隆挑选和斑点杂交筛选得到稳定高效高表达目的蛋白的CHO-S/pMH3-IL27和CHO-S/pMH3-IL27-Fc细胞株，Western blot鉴定目的蛋白分子量，选取表达量高的细胞株作为种子细胞冻存。 4.IL27和IL27-Fc重组蛋白的纯化 应用DMEM/F12培养基分别培养CHO-S/pMH3-IL27和CHO-S/pMH3-IL27-Fc工程细胞株，收获培养上清。将收获的IL27上清用镍亲和柱分离纯化，而IL27-Fc上清用琼脂糖亲和介质(ProteinA)分离纯化得到目的蛋白，SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。 5.IL27和IL27-Fc融合蛋白的生物学功能鉴定 通过查阅文献可知IL27可以抑制PC-3细胞的增殖，将PC-3细胞以一定的密度铺于96孔板中，37℃、5％CO2培养24h后，将IL27及IL27-Fc分别稀释成不同的浓度，加到96孔板中，然后于不同的时间点应用MTT法检测PC-3细胞的增殖情况，比较IL27和IL27-Fc融合蛋白体外PC-3细胞增殖抑制活性。 结果： 1.成功获得人白介素27亚基EBI3，P28基因和IgG1 Fc基因片段 人外周血单个核细胞经过GM-CSF和IL4共同诱导和LPS刺激成功转变为树突状细胞，分别提取树突状细胞和人外周血单个核细胞的总RNA，经逆转录和PCR扩增后成功得到EBI3和p28基因及IgG1 Fc基因片段。 2.成功构建pMH3-IL27和pMH3-IL27-Fc重组表达质粒 菌液PCR和质粒双酶切(EcoRI和NotI)鉴定均为阳性后，将质粒送往公司测序，测序结果显示重组质粒在EBI3片段存在一个点突变，即第90位的C突变为T，但为同义突变，并没有导致氨基酸的改变（CCC突变为CCT，都是脯氨酸密码子）。 3.成功筛选获得稳定高效表达IL27和IL27-Fc融合蛋白的CHO-S细胞株 将构建成功的pMH3-IL27和pMH3-IL27-Fc重组表达质粒应用电转法分别导入CHO-S细胞中，通过G418筛选及单克隆细胞株的挑选，Dot Blot检测，选取了稳定高效表达IL27和IL27-Fc融合蛋白的细胞株作为种子细胞冻存。 Western blot检测显示，还原状态下IL27在54KD处出现特异的目的条带。IL27-Fc融合蛋白还原状态下在80KD处出现目的条带，非还原状态在160KD处出现特异的目的条带，说明蛋白是以二聚体形式存在，两个蛋白的分子量与我们预测分子量一致。 4.IL27和IL27-Fc融合蛋白的纯化 收集CHO-S-IL27细胞株的培养上清，应用镍柱亲和层析纯化浓缩，SDS-PAGE和Western blot鉴定分析纯化后的蛋白，SDS-PAGE分析纯化浓缩后目的蛋白纯度约为90％。收集CHO-S-IL27-Fc细胞的培养上清，应用ProteinA亲和柱纯化，SDS-PAGE和Western blot分析，纯化后的IL27-Fc融合蛋白以二聚体存在，目的蛋白纯度约为96％。 5.IL27和IL27-Fc融合蛋白体外生物学功能的鉴定 MTT法检测IL27和IL27-Fc融合蛋白对PC-3细胞的增殖抑制情况，结果显示，IL27及IL27-Fc融合蛋白均可以抑制PC-3细胞的增殖，且随着蛋白浓度的升高，对PC-3细胞的增殖抑制作用越明显，呈明显的剂量依赖性。而且IL27-Fc融合蛋白抑制PC-3增殖的活性明显高于IL27。 结论： 本实验成功建立了IL27和IL27-Fc融合蛋白的真核表达系统，构建pMH3-IL27和pMH3-IL27-Fc重组表达质粒，通过转染导入CHO-S细胞，G418筛选获得稳定高效表达IL27和IL27-Fc融合蛋白的细胞株。通过镍柱和Protein A亲和层析制备IL27和Ⅱ27-Fc融合蛋白，并通过体外PC-3细胞增殖抑制试验初步证实了IL27和IL27-Fc融合蛋白在体外均具有生物学活性，且此活性与浓度呈剂量依赖性，为后续IL27抗肿瘤作用的研究及对自身免疫性疾病治疗的临床前研究和抗病毒作用的研究奠定了坚实的基础。