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目的人巨细胞病毒(HCMV)是导致感染性先天性耳聋最主要的病原体。病毒感染所致的内耳感觉上皮细胞及神经节细胞的缺失是引起先天耳聋最直接的病因。HCMV编码的免疫调节分子在病毒致病机制中发挥重要作用。HCMV UL128蛋白具有人p-趋化因子的结构特征,迄今对UL128的趋化因子功能鉴定尚未见报道,也缺乏其在HCMV感染性先天性耳聋发病机制中的作用的相关资料。明确UL128的β-趋化因子功能,并在HCMV感染内耳感觉上皮细胞模型基础上探索UL128在HCMV感染性耳聋发病机制中的作用,为深入阐明HCMV感染性耳聋的发病机理提供新的切入点,并为寻求HCMV相关耳聋防治的新途径奠定理论基础。方法研究主要包括四大部分：1)真核表达载体的构建及重组UL128蛋白的纯化：应用PCR法从HCMV AD169株DNA中扩增UL128基因,插入6×His-Tag标签序列,克隆入质粒载体,构建pIRES-AcGFP-UL128真核表达系统,将其转染CHO细胞,收集稳转细胞培养上清,His·Bind树脂柱纯化带有融合蛋白标签的重组UL128蛋白；2) UL128趋化功能鉴定：进行Transwell趋化性试验、受体配体交联试验及流式细胞术检测Fluo-3/AM荧光法鉴定UL128的趋化特性；3)人耳蜗上皮细胞的分化培养及HCMV感染耳蜗细胞模型的建立：显微外科手术分离耳蜗基底膜的上皮组织,机械分离及胰酶消化获得原代细胞,进行上皮细胞的分化培养,采用细胞免疫荧光法进行标记物鉴定；接种HCMVAD169病毒于耳蜗上皮细胞,倒置相差显微镜下观察细胞形态、PCR检测HCMV IE基因、免疫荧光法检测病毒晚期蛋白PP65,建立HCMV体外感染耳蜗细胞模型；4) UL128对HCMV感染耳蜗上皮细胞及PBMC的影响：通过靶基因序列的结构分析、干扰位点预测及序列同源性检测,设计4对针对UL128序列的siRNA片段,经高效液相色谱法纯化去除单链RNA,实时荧光定量PCR法筛选UL128有效干扰片段,获得HCMV UL128缺陷病毒株；将HCMV野生株与UL128缺陷病毒株分别感染人内耳感觉上皮细胞,比较两者在病毒毒力及致细胞病变上的差异；建立人PBMC与内耳感觉上皮细胞(预感染病毒)的体外共培养体系,流式细胞技术检测转染和未转染siRNA的共培养上清在炎症因子表达上的差异,同时采用MTT比色法及Western Blot免疫印迹技术检测UL128对PBMC细胞活力以及信号通路(MAPKs/P13K)的影响。结果成功构建UL128重组蛋白(rUL128)真核表达系统,实现HCMV UL128基因体外高效、稳定的表达。成功将6×His-Tag融合蛋白标签插入目的蛋白的N氨基末端,纯化获得分子量约为26KD的rUL128,浓缩得到浓度为O.1mg/ml的目的蛋白,银染结果显示其纯度高,无杂蛋白影响。体外趋化试验证实rUL128(100ng/ml)具有趋化PBMC的作用,趋化指数为1.69±0.54,类似人β-趋化因子MIP-1α(趋化指数为1.58±±0.34,p>0.05),rUL128趋化PBMC的作用无明显浓度依赖性。免疫组化及PCR结果显示rUL128具有结合PBMC胞膜受体的功能,rUL128及MIP-1α结合PBMC胞膜受体平均阳性细胞百分比分别为13%和12.6%。浓度为50ng/ml和100ng/ml的rUL128均可使PBMC胞内Ca2+浓度呈现短暂升高,rUL128蛋白具有活化PBMC的功能。成功分离获得耳蜗感觉上皮细胞及原始祖细胞。成熟的毛细胞体外培养存活时间短(3d～7d),无再生能力,原始祖细胞体外环境下可分化培养为感觉上皮细胞,初始细胞同时表达支持细胞和毛细胞的标记蛋白。分化获得的耳蜗上皮细胞具有再生增殖能力。成功构建HCMV感染耳蜗上皮细胞模型。HCMV感染耳蜗上皮细胞96h显微镜下可见典型的细胞病变效应,PCR检测结果显示HCMV IE基因在感染细胞内活跃表达,细胞免疫荧光结果证实病毒晚期蛋白PP65于感染细胞内丰富表达,证明分化获得的耳蜗上皮细胞为HCMV增殖性感染的容纳细胞。成功将UL128特异性siRNA转染入宿主细胞,实时荧光定量PCR检测UL128mRNA,结果显示siRNA2在同等条件下(1μlLipofectamin、同等培养细胞)对UL128mRNA的转录和表达具有最佳抑制作用,抑制率在75%以上,浓度为50nM siRNA2对UL128mRNA的转录抑制作用最显著。不同时间点RNA干扰效果不同,siRNA2于24h及48h具有最佳干扰效果。干扰UL128基因表达后,缺陷病毒株致细胞病变效应及子代病毒的产生与HCMV野生病毒株相比差异无显著性。HCMV野生病毒株感染组织细胞与PBMC共培养体系,致共培养上清炎症因子IL-6、TNF-α释放明显增加,且IL-6的表达具有时间累积效应(感染时间越久,IL-6上升越明显)；RNA干扰获得的UL128缺陷病毒株致PBMC炎症因子释放能力明显削弱。rUL128(50ng/ml)处理PBMC,48h检测细胞活力,处理组PBMC增殖活力高于阴性对照组(p<0.01).UL128(50ng/ml)激活PBMC胞内MAPK/ERK信号转导通路,Western Blot结果显示处理组30min和60min均可见pERK1/2的表达,空白对照组未检测出磷酸化ERK蛋白。结论1.通过pIRES-AcGFP-UL128重组质粒转染CHO细胞可实现UL128基因体外高效、稳定的表达,借助6×His-Tag融合蛋白标签,可获得分子结构及生物功能接近天然蛋白的rUL128蛋白。2.rUL128体外具有趋化PBMC、结合PBMC胞膜受体、激活PBMC引起胞内Ca2+内流的能力,其作用类似人β-趋化因子MIP-1α,证实UL128为HCMV编码的β-趋化因子。3.UL128作为HCMV编码的β-趋化因子,能够通过MAPK/ERK信号转导通路促进PBMC的增殖,上调炎症因子IL-6和TNF-α的表达,参与调控宿主免疫,在引起过度炎症反应及组织损伤机制中可能发挥重要作用。4.出生后的人耳蜗基底膜组织存在具有增殖分化能力的原始祖细胞,该原始细胞在一定条件下可分化为表达支持细胞和毛细胞特征标记物的上皮细胞系,而成熟的毛细胞体外存活时间短,不具备增殖再生能力。5.成功构建HCMV-人耳蜗上皮细胞的感染模型,证实分化获得的耳蜗上皮细胞为HCMV增殖性感染的容纳细胞。6.体外合成的UL128siRNA干扰片段能被顺利转入靶细胞并干扰HCMVUL128基因的表达,靶向干扰特异性高,抑制效果明显；干扰后的病毒株致炎症因子IL-6和TNF-α的产生明显减少,UL128基因可作为HCMV感染相关性耳聋治疗的潜在靶位点。