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第一部分 MSP与脑出血的相关性研究目的:研究小鼠脑出血(ICH)后脑组织中蛋白MSP及其膜受体蛋白RON在ICH后不同时间点的变化及在脑组织中的分布情况。方法:选取8周大小体重在25-35g之间的CDI成年小鼠,随机分为假手术组(Sham)和脑出血+溶剂组(ICH+Vehicle),其中ICH+溶剂组(ICH+Vehicle)又分为3h、6h、12h、24h和72h这5个亚组,每组6只小鼠。采用Western blot来评估小鼠脑出血后3h、6h、12h、24h、72h内源性MSP和RON的表达变化。通过免疫荧光双重染色来观察小鼠脑出血后MSP和RON在内皮细胞、星形胶质细胞和神经元中的表达情况。结果:实验结果表明:1、小鼠脑出血后脑组织中MSP表达及p-RON/RON从ICH后3h出现下降(P<0.05);2、在小鼠脑出血后MSP和RON主要在内皮细胞、星形胶质细胞中表达,在神经元中表达较少。结论:1、鼠脑出血后脑组织中MSP表达及p-RON/RON下降;2、MSP和RON主要在星形胶质细胞和内皮细胞中高表达,而血肿周围区域神经元中的表达较少。第二部分MSP在脑出血后血脑屏障损伤诱发继发性脑损伤中的保护作用目的:探索小鼠经鼻吸入重组人MSP对小鼠脑出血预后及血脑屏障保护作用方法:选取8周大小体重在25-35g之间的CD1成年小鼠,随机分为以下几组:分别是:假手术组(Sham),ICH+溶剂组(ICH+vehicle)(n=12),ICH+低剂量重组人MSP组(ICH+rhMSP,每只给药0.1μg,经鼻吸入给药)(n=6),ICH+中剂量重组人MSP组(ICH+rhMSP,每只给药0.3μg,经鼻吸入给药)(n=6),ICH+高剂量重组人MSP组(ICH+rhMSP,每只给药1μg,经鼻吸入给药)(n=6),Sham+Evans Blue组(n=6),ICH+vehicle+Evans Blue 组(n=6),ICH+rhMSP(最佳剂量)+Evans Blue组(n=6),ICH+rhMSP(最佳剂量)组(n=12),sham(72h)组(n=6),ICH(72h)+vehicle 组(n=6),ICH(72h)+rhMSP(最佳剂量)组(n=6)。采用脑水含量及神经行为学评分测试三种不同剂量的rhMSP(0.1 μg,0.3 μg,1.0μg)治疗效果。采用Western blot来观察小鼠脑出血后紧密连接蛋白的表达变化及白蛋白的渗出情况,从而评估血脑屏障的破坏程度。采用Evans blue外渗试验试验来评估血脑屏障的破坏程度。结果:实验结果表明:1、在三个rhMSP治疗剂量中,rhMSP(0.3μg)剂量治疗减少的脑水肿量的程度最大。小鼠的神经功能得到的改善最明显;2、rhMSP治疗组与ICH组相比,伊文氏蓝染料外渗明显减少,3、rhMSP治疗组与ICH组相比,白蛋白的渗出量明显减少,claudin-5,occludin和ZO-1等紧密连接蛋白的表达量明显增加。结论:1、rhMSP能够降低ICH后脑水肿情况及改善ICH后神经功能的损伤;2、rhMSP能够维护BBB结构的完整性,这一效应是通过调控紧密连接蛋白来实现的。第三部分 MSP/RON信号通路对小鼠脑出血后血脑屏障损伤保护作用机制的实验研究目的:通过侧脑室注射干扰siRNA研究MSP潜在的保护血脑屏障作用机制方法:选取8周大小体重在25-35g之间的CD1成年小鼠,随机分为以下6组,分别是:假手术组(Sham),ICH+溶剂组(ICH+vehicle),ICH+rhMSP 组,ICH+rhMSP+Scrambled siRNA 组,ICH+rhMSP+RON siRNA 组,ICH+rhMSP+GAB 1 siRNA组,其中Sham组、ICH+vehicle组和ICH+rhMSP组每组20只小鼠,其余每组12只小鼠。其中rhMSP给药剂量均为每只0.3 μg,给药方式为经鼻吸入给药。干扰siRNA侧脑室注射的方法注射到小鼠侧脑室内。1、我们通过短期神经行为学功能测定来验证RON siRNA和GAB1 siRNA通过侧脑室注射是否起到干扰作用。2、通过Western blot来验证rhMSP是否通过RON/GAB1/Src/β-catenin这一信号通路来起到保护血脑屏障的作用3、在RON siRNA和GAB1 siRNA的干扰下分别通过Western blot检测细胞质和细胞核内β-catenin蛋白的表达变化进一步验证rhMSP是否通过促进β-catenin在细胞核内的定位来调控下游的紧密连接蛋白,进而起到稳定血脑屏障完整性的作用。4、在RON siRNA和GAB1 siRNA的干扰下通过检测白蛋白的渗出量来检测MSP或RON蛋白表达受到干扰时脑出血后血脑屏障的破坏程度的变化。5、通过水迷宫实验来检测rhMSP是否对小鼠脑出血后长期神经行为学功能是否也有改善。结果:1、在给予RON siRNA和GAB1 siRNA的干扰后,rhMSP提高脑出血后p-RON/p-GAB1/p-Src/β-catenin蛋白表达的这一效应得到逆转;2、给予RON siRNA和GAB1 siRNA的干扰后逆转了 rhMSP的改善神经行为学功能效应。3、RhMSP通过促进β-catenin在细胞核内的定位来调控下游的紧密连接蛋白;4、在给予rhMSP治疗的同时给予RON siRNA和GAB1 siRNA的干扰后白蛋白的渗出明显增多;5、rhMSP对小鼠脑出血4周后的记忆和学习能力方面有显著改善。结论:1、MSP 激活 RON/GAB1/SRC/β-catenin 信号通路,使 β-catenin 从细胞质转移到细胞核中来调控紧密连接蛋白,从而维持BBB的完整性;2、rhMSP能够改善ICH后长期神经功能的损伤。