狂犬病至今依然是一种严重的公共健康威胁,尤其是在发展中国家和地区。我国每年因狂犬病死亡的人数超过2000,然而狂犬病的发病机制至今依然不清楚,也缺乏有效的治疗手段,使得其病死率接近100%。狂犬病的病原主要是狂犬病病毒(RABV),RABV病毒粒子由5种结构蛋白(核蛋白、磷蛋白、基质蛋白、糖蛋白和大蛋白)及负链基因组RNA组成。为了弄清RABV的致病机制,近年来学者们一直致力于研究RABV病毒粒子各组分与宿主各种生物学过程之间的相互作用,如RABV结构蛋白对宿主固有免疫的影响等,希望能借类似的研究找到治疗狂犬病的手段。可喜的是,最近对RABV的研究取得了很大的进展,比如科学家发现RABV磷蛋白可以抑制宿主的干扰素通路,通过改变磷蛋白的这种能力可以影响病毒的毒力;又比如日本科学家发现RABV核蛋白也可以影响干扰素的激活,通过改变核蛋白的氨基酸组成可以减弱病毒的毒力。然而,依然有很多问题需要我们去解决,例如RABV的干扰素抑制能力与病毒毒力是否存在某种必然联系;RABV磷蛋白及核蛋白均可以影响干扰素的激活,那么其它蛋白是否也具有这种能力;RABV对干扰素的抑制能力在病毒感染过程中扮演一个什么角色,这些问题都还不清楚。鉴于此,我们设计实验开展了本课题。我们选择了一株在世界范围内大规模应用于疫苗生产的RABV弱毒株SRV9和一株在中国广泛流行的强毒株BD06,利用对比研究的方法分析了它们在体内以及体外感染造成的基因表达差异,同时分析了两株病毒结构蛋白的干扰素拮抗能力,以弄清两株病毒结构蛋白干扰素拮抗能力与病毒毒力之间的关系。具体研究过程如下:我们首先筛选条件获取了在细胞上培养的较高滴度的BD06,并对其进行了鉴定,确定没有发生关键性突变,且毒力没有减弱;然后我们利用脑内攻毒的方法,将相同毒量104ffu(30μl)的强毒BD06和弱毒SRV9以及培养基对照接种Balb/c小鼠,观察两株病毒感染的过程,结果发现SRV9完全不致病,只是在感染的初期造成了感染病毒小鼠体重的下降,而感染BD06的小鼠在第5天全部发病,并在第6天到第7天全部死亡;鉴于两种病毒完全不一致的感染结果,而小鼠大脑对病毒的抵抗尤其是早期主要依赖于固有免疫,对RABV来说,宿主的固有免疫主要以干扰素相关反应为核心,因此我们分析了小鼠感染两株RABV的干扰素反应。分别将感染两株病毒后第2天、第4天和第6天的小鼠取脑组织提取RNA,利用定量PCR的方法分析了干扰素β(IFNβ)及其诱导的抗病毒反应相关蛋白OAS-1G和Mx1的表达。结果发现SRV9在感染后第2天即可激活较高水平的干扰素反应,并在第4天达到峰值,而在第6天出现明显的回落;但是BD06感染的小鼠在第2天表现出一个相对较弱的干扰素反应,在第4天明显升高,而在第6天小鼠发病濒死时仍持续升高。二者的干扰素反应动力学差别很大,BD06感染诱导的干扰素反应早期较弱而晚期较强与SRV9构成显著差别。我们接下来对比了两株RABV感染293细胞后,细胞基因表达谱的变化。利用Ion proton平台对RABV感染的293AD细胞转录组进行测序。每个样品共获得了约1200万个reads,比对到参考基因和参考基因组之后,都能够获得大于80%的比对率,说明测序结果可靠。对所有读数比对到参考基因后利用RPKM对基因的表达进行了归一化,并对BD06和SRV9相对于对照以及BD06相对于SRV9的基因表达变化进行了定量分析,分别找到了2317(SRV9相对于对照),3331(BD06相对于对照)和2760(BD06相对于SRV9)个差异表达的基因。对这些差异表达的基因进行聚类分析,发现根据GO分类进行的聚类中,SRV9及BD06相对于对照发生改变的基因并没有明显的底层条目聚集,而当我们将BD06对SRV9的表达差异进行聚类分析时,发现差异表达的基因在细胞因子这一条目聚集。对差异表达的基因基于KEGG注释做了通路分析,结果发现BD06造成的表达差异向病毒感染相关通路聚集,而SRV9的感染的差异基因富集不明显。说明在感染的早期,BD06与细胞的相互作用相对于SRV9更加激烈。考虑到RABV结构蛋白对固有免疫有拮抗作用,我们接着分别对比了BD06及SRV9对干扰素通路抑制能力的差别。利用RIG-I蛋白N端的CARDs结构域可以激活类似于RABV激活的固有免疫反应,所以为了排除非相关成分对实验结果的干扰,我们没有选择用RABV或者诸如VSV之类的病毒来激活细胞的固有免疫,而是选择直接转染表达人RIG-I-CARDs的真核载体以激活细胞的固有免疫,主要是RIG-I依赖的IFNβ相关通路。然后我们分别转染表达载体对照及SRV9或BD06核蛋白、磷蛋白、基质蛋白或糖蛋白的真核质粒,在细胞同时过表达RIG-I-CARDs以及RABV结构蛋白,用免疫印迹检测这些基因在细胞中的过表达后,用定量PCR的方法检测细胞的干扰素反应,包括检测IFNβ以及IFNβ诱导基因PKR和OAS的表达水平以对比分析RABV结构蛋白对干扰素激活的抑制能力。结果发现RABV磷蛋白表现出主要的对IFNβ激活的抑制能力,且磷蛋白的对干扰素通路的抑制能力要在SRV9和BD06之间存在显著差异。尽管有报道表明RABV核蛋白对干扰素通路激活也存在抑制能力,但是我们表达核蛋白时,发现核蛋白对RIG-I激活的抑制作用不显著。另外尽管与RABV类似的弹状病毒VSV基质蛋白对干扰素激活有抑制能力,但是RABV的基质蛋白并没有表现出这种能力,同时糖蛋白也不能拮抗干扰素的激活过程。由以上研究,可以得出结论如下:狂犬病病毒弱毒SRV9株能在感染小鼠大脑后迅速诱导固有免疫反应,并在感染中期达到峰值,但是会在感染后期回落;而强毒株BD06株则在感染早期产生相对较弱的干扰素反应,但是会随着感染持续加强。两株病毒的干扰素反应动力学存在显著差异,且单纯的干扰素反应并不足以清除病毒,保护动物免受死亡。狂犬病病毒弱毒株SRV9株诱导细胞基因表达的变化是普遍的,但是富集程度不高,BD06相对于SRV9发生的基因表达变化在功能上向细胞因子这一分类富集,在通路上向抗病毒反应相关通路富集。BD06在感染诱导更明显的固有免疫反应。狂犬病病毒磷蛋白表现出主要的干扰素拮抗活性,核蛋白对干扰素通路的影响是间接的,而糖蛋白基质蛋白不具备这种能力。BD06株磷蛋白的干扰素拮抗能力弱于SRV9磷蛋白,而两株病毒核蛋白的干扰素通路抑制能力无差别。强毒BD06株狂犬病病毒对干扰素激活的抑制能力弱于SRV9株。狂犬病病毒结构蛋白对干扰素的拮抗能力与病毒毒力之间缺乏正相关性。