促性腺激素释放激素（Gonadotropin Releasing Hormone，GnRH），是一种十个氨基酸的短肽，在繁殖过程中起着非常关键的作用。在过去的几十年中，研究发现应用GnRH为基本抗原构建的疫苗免疫动物以后可以中和内源性的GnRH，进而调节机体内促性腺激素和性腺激素的生成和分泌，因此GnRH疫苗应用于人类、家畜、宠物和野生动物可以抑制其生育能力和繁殖行为。然而，化学合成肽疫苗和基因工程疫苗存在提纯难度大、免疫时间短和容易恢复等问题。所以非常有必要研究一类新的GnRH疫苗。　　本研究应用基因克隆、细胞培养、RT-PCR、Western blot、ELISA、RIA和HE染色等试验技术手段，将HBsAg亚克隆到真核表达载体pVAX1中，将GnRH和2种GnRH类似物基因片段分别插入其3末端，以及3末端和中间端分别得到了单拷贝和双拷贝的GnRH重组表达质粒，将pVAX-SG和pVAX-S2G质粒用脂质体法转染到HeLa细胞中进行表达鉴定。将重组表达质粒进行肌肉注射免疫小鼠，检测小鼠血浆中GnRH IgG抗体水平，并且检测GnRH、促卵泡素（Follicle Stimulating Hormone,FSH）、促黄体素（Luteinizing Hormone,LH）和睾酮（Testosterone,T）的浓度，最后观察小鼠睾丸结构。旨在探讨以GnRH的氨基酸替换和双拷贝后对GnRH基因疫苗免疫和去势效果的影响。为开发高效、安全、廉价的去势疫苗奠定理论基础，并提供技术支撑。　　1.GnRH基因疫苗质粒的构建与鉴定　　扩增pcMV-S质粒，得到705bp的HBsAg片段，将其亚克隆到真核表达载体pVAX1中。化学合成6对GnRH及在第5位和第8位替换为组氨酸和酪氨酸的GnRH类似物单链核苷酸片段，退火形成双链基因片段。再将3对末端的GnRH和其类似物的基因片段连接到HBsAg的3末端，形成pVAX-SG、pVAX-SG5H和pVAX-SG8Y等3种单拷贝的真核表达质粒；再将3对中段的GnRH和其类似物的基因片段插入到单拷贝质粒的HBsAg的第112-113氨基酸之间，形成pVAX-S2G、pVAX-S2G5H和pVAX-S2G8Y的双拷贝重组表达质粒，上述质粒经酶切和测序鉴定，结果表明，基因的方向、插入位点和序列均完全正确，成功得到6个GnRH重组表达质粒。　　2.GnRH重组表达质粒在真核细胞中的转录和表达鉴定。　　将构建的pVAX-SG和pVAX-S2G的重组表达质粒经脂质体转染HeLa细胞，在转染24h后提取细胞总RNA，进行RT-PCR，结果表明转录成功；在转染48h后提取细胞总蛋白，进行Western blot分析表达产物，结果表明构建的重组质粒能够在细胞中成功表达出27kD的融合蛋白，而且表达的GnRH融合蛋白具有GnRH的免疫学活性，表明重组表达质粒能在真核细胞中成功的进行转录和表达。　　3.GnRH基因疫苗对小鼠免疫应答和去势的影响　　将pVAX-SG（T2组）、pVAX-S2G（T3组）、pVAX-SG5H（T4组）、pVAX-S2G5H（T5组）、pVAX-SG8Y（T6组）和pVAX-S2G8Y（T7组）等6组重组表达质粒采用肌肉注射的方法分别免疫4周龄雄性昆明小鼠，并且设pVAX1（T1组）和生理盐水（C组）为空白对照组。在整个试验阶段，从小鼠的生理和行为来看，经过疫苗免疫的小鼠并没有发生炎症、病变和死亡的症状，而且体重也没有发生显著的变化，疫苗免疫的小鼠睾丸重量有所减小，但是差异不显著（P>0.05）。pVAX-S2G，pVAX-SG8Y和pVAX-S2G8Y质粒组可以成功地诱导小鼠体内产生特异性抗体，且显著性高于空白对照组（P<0.05），而pVAX-SG，pVAX-SG5H和pVAX-S2G5H质粒免疫小鼠抗体与对照组无显著差异。在抗体的中和作用下，T3组和T6组的GnRH浓度显著降低（P<0.05），而FSH、LH和T没有变化。有3只（T3组2只，T7组1只）小鼠睾丸的HE染色结果表明精子发生受到抑制、精子浓度降低、睾丸发生萎缩。　　上述结果表明双拷贝疫苗较单拷贝疫苗有更好的免疫效果；用酪氨酸替代GnRH第8位精氨酸后免疫抗体增加；用组氨酸替代第5位酪氨酸后对GnRH疫苗的免疫效果没有影响。