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高迁移率族蛋白B1(HMGB1)作为一种核蛋白,可以由坏死细胞被动释放或由单核/巨噬细胞在受到内外源炎性刺激发生免疫应答时主动分泌到细胞外。HMGB1与晚期糖基化终产物受体(RAGE)或Toll样受体4(TLR4)结合后,可以激活单核/巨噬细胞表达促炎因子、趋化因子和吸附因子。药物抑制这种激活和分泌可以保护机体避免发生致死性内毒素血症和败血症,从而证明了HMGB1是一种全身性致死性炎症的关键递质。越来越多的研究表明,释放至细胞外的HMGB1可作为一种多功能细胞因子,参与多种疾病的发生和发展,如脓毒症、关节炎、肿瘤等。目前对HMGB1的研究主要集中于哺乳动物,而家禽HMGB1的研究鲜有报道,因此本研究扩增特异性的鸡源高迁移率族蛋白B1(chHMGB1)基因,构建原核表达系统表达纯化重组chHMGB1蛋白,并制备了抗chHMGB1的亲和层析多克隆抗体和单克隆抗体,并以此初步建立了双夹心ELISA检测chHMGB1的方法,为临床家禽疾病中鸡源高迁移率族蛋白B1的检测提供了良好的技术手段。一.鸡源高迁移率族蛋白B1的克隆及原核表达根据鸡源高迁移率族蛋白B1(chHMGB1)基因序列,设计1对特异性引物,以CEF细胞中所提取的总RNA为模板,扩增出了chHMGB1基因,并将扩增片段与pGEM-T Easy载体连接。测序正确后将目的基因克隆到表达载体pET-32a和pGEX-6p-1中,并转化入不同的表达宿主菌,经双酶切鉴定并测序正确后,用IPTG诱导pET-chHMGB1和GST-chHMGB1重组蛋白的表达。通过SDS-PAGE、Western blot及蛋白质测序结果表明,重组蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达。这为下一步制备抗chHMGB1特异性抗体奠定了基础。二.鸡源高迁移率族蛋白B1特异性抗体的制备根据与哺乳动物的基因序列分析比对,选取一段鸡源高迁移率族蛋白B1(chHMGB1)的特异性多肽序列,偶联载体后作为抗原免疫新西兰兔,并利用偶联的多肽抗原纯化阳性兔IgG,得到亲和层析纯化的多克隆抗体,命名为chHMGB1-5527。同时将此多肽与研究内容一中原核表达纯化的pET-chHMGB1重组蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,筛选制备抗chHMGB1的单克隆抗体。通过间接ELISA和／或间接免疫荧光(IFA)筛选,共获得10株抗chHMGB1的单克隆抗体,将其中2株间接ELISA与IFA均反应良好的IgG单抗制备腹水并纯化,分别命名为chHMGB1-2E5、 chHMGB1-3G3。对所获得的亲和层析多克隆抗体和2株单克隆抗体通过间接ELISA测定了抗体效价,并利用Western blot法、间接免疫荧光染色、免疫组化方法进行了鉴定。本研究成功制备了抗鸡源高迁移率族蛋白B1特异性的多克隆抗体和单克隆抗体,各项实验结果表明所得抗体能特异性识别重组蛋白及天然的chHMGB1蛋白,为chHMGB1蛋白的功能研究及建立检测天然chHMGB1的方法提供了条件。三.双夹心ELISA检测鸡源高迁移率族蛋白B1方法的初步建立将研究内容二中纯化的两株单克隆抗体chHMGB1-2E5、chHMGB1-3G3及亲和层析多克隆抗体chHMGB1-5527进行了生物素标记,分别作为捕捉抗体和检测抗体进行组合,用原核表达的重组蛋白GST-chHMGB1作为检测抗原,进行了双夹心ELISA检测方法的摸索,结果建立chHMGB1-2E5/Bio+chHMGB1-5527和chHMGB1-5527/Bio+chHMGB1-5527两种较优组合的抗体夹心ELISA检测方法。该方法检测原核表达融合蛋白GST-chHMGB1的灵敏度达到6.25ng。用建立的双夹心ELISA方法检测正常细胞裂解液上清,结果呈阳性反应,表明该方法可检测到细胞中天然的HMGB1,为进一步的临床检测家禽疾病中的目的蛋白提供了检测方法。