雷公藤内酯醇对SKOV3/DDP细胞黏附、侵袭和转移能力的影响及机制探讨

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目的:观察雷公藤内酯醇(TPL)对耐顺铂(DDP)人上皮性卵巢癌细胞株SKOV3/DDP黏附、侵袭和转移能力的影响并探讨其作用机制。方法:根据不同药物浓度分组为:(1)空白对照组(NC组),(2)DDP组(10μg/mL),(3)TPL组(8ng/mL),(4)联合组(10μg/mL DDP+8ng/mL TPL);作用于SKOV3/DDP细胞后,分别进行黏附、侵袭、迁移和划痕实验,并采用Western blotting检测SKOV3/DDP细胞内整合素β1、基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)的蛋白表达水平。1、黏附实验:96孔板用matrigel基质胶包被,将SKOV3/DDP细胞经各个实验组处理后,分别制成单细胞悬液接种于96孔板中,37℃培养30min,结晶紫染色后倒置显微镜下观察,细胞计数,计算细胞黏附率。2、侵袭实验:在Transwell小室的上表面铺matrigel基质胶,按实验分组将细胞接种至Transwell小室上室中;Transwell小室下室中加入含10%FBS的RPMI-1640培养基;细胞培养24h后,结晶紫染色,倒置显微镜下观察穿膜细胞并计数,计算细胞侵袭率。3、迁移实验:按实验分组将细胞接种至Transwell小室上室中,Transwell小室下室中加入含5%FBS的RPMI-1640培养基;培养24h后,结晶紫染色,倒置显微镜下观察穿膜细胞,并在570nm波长的酶标仪上测定各组转移细胞的OD值,计算细胞迁移率。4、划痕实验:取对数期细胞接种于6孔板中,培养SKOV3/DDP细胞至形成单细胞层,再饥饿培养24h后,按实验分组加入不同干预,在培养板底部“一”字划痕,分别于给药后0h、24h倒置显微镜下观察照相,使用Adobe Photoshop软件测量每张图片中的划痕面积,计算24h划痕愈合面积。5、Western blotting:检测各实验组药物作用于SKOV3/DDP细胞24h后,细胞内整合素β1、MMP-2及MMP-9的蛋白表达水平。结果:1、SKOV3/DDP细胞经不同药物作用后,各实验组细胞黏附率如下:对照组(100%±7.71%)>DDP组(67.73%±10.69%)>TPL组(47.92%±5.54%)>联合组(23.01%±5.04%);各组间比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结果显示TPL可以抑制SKOV3/DDP细胞的黏附能力,且其抑制能力强于DDP;两者联合应用,其抑制力优于单药组,说明TPL对DDP有增敏作用。2、SKOV3/DDP细胞经不同药物作用后,各实验组细胞侵袭率如下:对照组(100%±11.87%)>DDP组(51.14%±11.92%)>TPL组(14.79%±3.93%)>联合组(3.94%±0.82%);各组间比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结果显示TPL可以抑制SKOV3/DDP细胞的侵袭能力,且其抑制能力强于DDP;两者联合应用,其抑制力优于单药组,说明TPL对DDP有增敏作用。3、SKOV3/DDP细胞经不同药物作用后,各实验组细胞迁移率如下:对照组(100%±19.86%)>DDP组(77.68%±3.62%)>TPL组(35.83%±1.14%)>联合组(22.69%±2.64%);各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结果显示TPL可以抑制SKOV3/DDP细胞的迁移能力,且其抑制能力强于DDP;两者联合应用,其抑制力优于单药组,说明TPL对DDP有增敏作用。4、SKOV3/DDP细胞经不同药物作用后,各实验组细胞24h划痕愈合面积如下:对照组(66.64±6.04)>DDP组(53.27±6.23)>TPL组(44.22±3.65)>联合组(29.41±10.37);各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结果显示联合组的划痕愈合面积最小,TPL组次之,与DDP组及对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。5、SKOV3/DDP细胞经不同药物作用后,对照组、DDP组、TPL组及联合组的各蛋白相对灰度值如下:MMP-2蛋白:1.033±0.039、0.975±0.045、0.596±0.013、0.322±0.007;MMP-9蛋白:1.333±0.222、1.007±0.190、0.641±0.152、0.235±0.046;β1整合素:0.922±0.103、0.532±0.227、0.376±0.156、0.143±0.130。结果显示TPL组的各蛋白表达水平均低于DDP组及对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。DDP组的各蛋白表达水平均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。联合组的各蛋白表达水平最低,与另外3组相比差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:1、TPL对SKOV3/DDP细胞的黏附、侵袭和转移能力有明显的抑制作用,且其抑制能力强于DDP。两者联合应用,其抑制力优于单一的DDP和TPL,说明TPL有增敏DDP抗SKOV3/DDP细胞黏附、侵袭和转移能力的作用。2、TPL可能通过下调整合素β1和基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的表达来抑制SKOV3/DDP细胞的黏附、侵袭和转移。
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