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杨树是重要的速生用材树种。随着毛果杨基因组测序的完成和相关遗传学和生物信息学研究的开展,目前杨树已成为公认的木本模式植物。对于许多生物学问题,例如木材形成、细胞壁次生生长、多年生生长、开花调控、生物进化、逆境胁迫响应等,杨树具有重要的研究价值。miRNA是一类广泛存在于动植物的内源调控小分子RNA,在植物中主要通过序列互补介导靶mRNA的降解以抑制靶基因的表达,从而参与植物发育调控与逆境胁迫响应。研究miRNA有助于揭示很多生命现象的分子机理,并可能应用于作物和林木的遗传改良。本文研究了杨树7个保守程度不同的miRNA基因家族的分子进化模式,进一步通过降解组分析鉴定miRNA靶基因并进行基因本体富集分析,并对2个miRNA靶基因进行了分离克隆与功能分析。主要研究结果如下：1.杨树MIR169基因家族的分子进化分析。串联重复和16.6～83.1百万年前的染色体大片段重复在毛果杨MIR169基因家族扩张中均发挥了重要作用；部分重复基因在进化过程中丢失；植物MIR169基因在单子叶植物与双子叶植物分化前已经分化为MIR1691和MIR1692两个家族,在杨树中又分别从MIR1691和MIR1692家族中分化出MIR1694和MIR1693家族。MIR169基因家族在表达方式上已经出现了较大的分化,其中MIR169u在多种组织中具有最高的表达活性；杨树MIR169基因家族的预测靶基因包括转录因子、蛋白激酶等多种基因,其中转录因子NF-YA是杨树MIR169主要的靶基因；MIR169基因家族可能在杨树中形成了复杂的调控网络,对杨树的生长发育和适应性等具有重要的调控作用。2.杨树MIR171基因家族的分子进化分析。杨树MIR171基因家族主要通过48～54百万年前的染色体大片段重复进行扩张,其表达方式已经出现分化,其中MIR171l/m/n在多种组织中具有最高的表达水平。MIR171基因家族可能主要通过调控GRAS转录因子和信号转导蛋白参与杨树生长发育、光信号转导和光形态建成的调控。3.杨树MR156基因家族的分子进化研究。杨树MIR156基因家族主要通过染色体大片段重复实现扩张,而串联重复对此没有贡献；不同家族成员表达方式已经分化,其中MIR156g/h/i/j表达活性最高；家族成员间启动子顺式作用元件存在差异；杨树MIR156的靶基因包括29个SBP结构域蛋白质基因,由于成熟序列存在差异,家族成员调控的靶基因也表现出差异,说明杨树MIR156基因家族成员的功能已经分化,在杨树中可能形成了复杂的调控网络。4.杨树4个新起源miRNA家族的进化。杨树MIR1444家族主要通过染色体大片段重复实现扩张,MIR1446家族主要通过染色体大片段重复和串联重复实现扩张,而非保守的MIR6425、MIR6462家族主要通过串联重复进行扩张；这4个基因家族成员的表达方式均已经分化,其中MIR1444、MIR1446在多种组织中具有较高的表达活性,而MIR6425、MIR6462仅具有较低的表达活性；MIR1446、 MIR6425、MIR6462家族内不同成员的成熟序列基本一致,其预测的靶基因也一致,而MIR1444家族中不同成员的成熟序列则出现了一定程度的分化,其预测的靶基因也不一致。对以上7个不同保守程度的miRNA基因家族的比较分析表明：起源较早、保守程度较高的miRNA基因家族成员数量较多,表达活性较高,功能分化程度较高,主要通过调控转录因子在杨树生命活动中发挥重要的调节作用；而起源较晚、保守程度较低的miRNA基因家族成员数量较少,表达活性较低,功能分化程度较低,其调控的靶基因多为酶等功能蛋白。5.杨树降解组分析与miRNA靶基因富集分析。构建了胡杨叶片降解组文库并进行高通量测序,获得42659177条原始序列,去除接头、污染序列及低质量序列后得到了34657804条干净序列用于降解组分析,共鉴定了23个miRNA靶基因。基因富集分析结果表明,胡杨叶片降解组分析中鉴定的miRNA靶基因富集于氧化还原酶活性和抗氧化活性,参与细胞氧化还原平衡的维持。这说明miRNA可能在杨树盐胁迫条件下对清除ROS、维持氧化还原的平衡具有重要的调控作用。对杨树、拟南芥和水稻高度保守和低度保守miRNA的预测靶基因分别进行单一富集分析和交叉比对。发现这三种植物的高度保守miRNA的预测靶基因都显著富集于转录因子,同时还发现杨树高度保守miRNA的预测靶基因显著富集于氧化还原过程,而低度保守miRNA靶基因富集程度较低。6.杨树miRNA靶基因的克隆与功能分析。从胡杨中克隆了MIR171的靶基因Pescll的全长cDNA, Pescll属于GRAS转录因子家族。RLM5’RACE实验证明Pescll存在miR171a-3p/b的靶位点。在盐胁迫条件下,Pescll表达水平上调,说明Pescll参与了杨树盐胁迫响应。从胡杨中克隆了MIR1444的预测靶基因Pecngcl的全长cDNA。 Pecngcl属于环核苷酸门离子通道基因家族。PeCNGCl定位于细胞膜,转Pecngcl能提高拟南芥的耐盐性。Pecngcl在叶片中表达,且其表达受盐胁迫条件的诱导,说明盐胁迫条件下Pecngcl可能对维持杨树叶片中Na+、K+的平衡发挥作用。