人工饲料养蚕是蚕业生产的一项重大技术革新。目前,国内外主要采用活体家蚕进行人工饲料配方及成分的物质能量代谢试验和饲养试验,但活体生物家蚕对饲料的适应性受季节、温度、品种品系等因素的影响较大。若采用肠上皮细胞的原代培养物对人工饲料的配方及营养效用进行评价研究,则可以避免上述影响。家蚕中肠是家蚕消化器官最发达的部分,它不仅是消化吸收营养的场所,也是进行物质和能量代谢的重要器官。目前,在家蚕的组织研究中,中肠的研究大多集中在物质代谢和细胞化学等方面,而中肠上皮细胞的原代培养及原代培养物对外来刺激的反应还鲜有报道。家蚕作为一种模式昆虫,应用家蚕培养细胞进行理论研究和生产应用倍受关注。虽然早在20世纪30年代,William Trager就开始了家蚕细胞培养的研究,但是到目前为止,仍没有家蚕中肠细胞系的研究报道,这主要是缺少理想的培养基和科学有效的培养方法,特别是成功的原代培养方法。本实验的研究目的在于：制备可用于家蚕细胞培养的去细胞血淋巴液及家蚕组织匀浆液。以家蚕中肠组织为材料进行原代培养,摸索原代培养的条件和方法。考察现行家蚕人工饲料主要成分对中肠细胞增殖的影响,为家蚕饲料开发研究提供细胞水平的依据。并期望最终为建立家蚕消化道细胞系,为药物药效的体外敏感性试验,提供前期实验铺垫。主要研究内容及结果如下：1.家蚕培养基及培养用液的制备本试验通过离心、过滤、透析等方法,获得家蚕去细胞血淋巴液,并通过添加维生素C防止酪氨酸酶氧化。制备得到的去细胞血淋巴液,呈淡黄色,透明状,稍有粘性,经测定pH值为6.3±0.3,蛋白浓度为25.4mg/100mL。家蚕经去除头部、消化管、马氏管、肛门后,得到的组织通过与PBS液混合匀浆,得到白色、透明状的家蚕组织匀浆液,经测定pH值为6.5±0.1,蛋白的浓度为69.6mg/100mL。2.家蚕中肠细胞的培养及生长指标的检测本试验以2-3龄眠期家蚕幼虫中肠组织为材料,分别以Grace’s培养基和家蚕组织匀浆为基础培养基,家蚕去细胞血淋巴液、胎牛血清、家蚕组织匀浆为辅加成分,配制6种不同营养成分的培养基(①Grace’s基础培养基+20%(V/V)家蚕组织匀浆液；②Grace’s基础培养基+20%(V/V)FBS;③Grace’s基础培养基+20%(V/V)家蚕去细胞血淋巴液；④家蚕匀浆液+20%(V/V)FBS；⑤家蚕组织匀浆液+20%(V/V)家蚕去细胞血淋巴液；⑥家蚕组织匀浆液)；取家蚕后部丝腺来源的丝素蛋白,制备成可供细胞生长的粘附材料；对中肠细胞进行原代培养,并对成功传代细胞的生长状况、细胞生长曲线、细胞分裂指数、细胞接种存活率等相关指标进行检测。通过对比不同培养基培养家蚕中肠细胞,发现以Grace’s培养基为基础,分别添加20%(V/V)家蚕去细胞血淋巴液和胎牛血清的实验组,细胞能在原代接种培养的第25d,稳定生长,并在70-75d,达到80%铺瓶率。传代培养后第45d,细胞达到80%铺瓶率。通过观察培养物主要由3种类型的细胞混合组成。分别为：呈扁平的梭型或卵圆型的细胞,单层生长,边界清晰；另一类细胞呈长梭型,中央有卵圆形核,排列整齐。同时还有少量的细胞呈纺锤形。通过对Grace’s基础培养基+20%(V/V)FBS组和Grace’s基础培养基+20%(V/V)家蚕去细胞血淋巴液组传代细胞的生长曲线和接种存活率的测定发现,第一次传代培养的细胞生长缓慢,接种后有7-10d的潜伏期,从22-45d和20-39d分别是这两组细胞的对数生长期。在45d和39d时,两组细胞浓度达到顶峰,达到80%铺瓶率。在其余3种完全培养基中,未观察到细胞。3.人工饲料成分对中肠细胞的刺激反应为进一步探讨家蚕人工饲料中原料的安全指标,以生长对数期的中肠细胞为对象,用不同的饲料成分原液刺激细胞,测定其对细胞增殖的影响。不同比例的桑叶汁(40%、20%、10%、5%),蚕蛹蛋白(15%、10%、5%、2.5%、1%),脱脂大豆粉(15%、10%、5%、2.5%、1%),山梨酸(10%、5%、2.5%、1%、0.5%),丙酸钙(10%、5%、2.5%、1%、0.5%),氯霉素(0.02%、0.01%、0.005%、0.002%、0.001%),土霉素(0.02%、0.01%、0.005%、0.002%、0.001%)的细胞增殖试验结果表明,桑叶各比列原液刺激细胞后平均细胞相对增殖率都大于90%,没有细胞毒性。脱脂大豆的浓度在2.5%以下,蚕蛹蛋白的浓度在5%以下,能保持细胞的增值活性。对于山梨酸、丙酸钙浓度大于2.5%则使细胞增值活性大幅度降低,细胞出现死亡。氯霉素和土霉素在0.005%的浓度以下,不会影响细胞的增殖,但是在72h,0.001%浓度的条件下,氯霉素和土霉素处理的家蚕中肠细胞都出现了II级的细胞毒性。细胞增殖实验为家蚕饲料开发研究提供细胞水平的依据。