第一章:Corin胞内段氨基酸序列对其细胞膜锚定的影响研究目的:Corin是一种首先在心脏中发现的Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶,其主要功能是将心房利钠肽前体(Pro-atrial natriuretic peptide,pro-ANP)转化成具有生物学活性的ANP。在肾脏中,ANP能提高肾小球滤过率,减少水钠重吸收,抑制肾素的释放;在外周血管中,ANP可以舒张血管平滑肌、降低血容量和血压,从而减轻心脏负荷,改善心脏功能。Corin是以无活性的单链酶原形式在细胞内核糖体中合成,需要锚定到细胞膜上之后,被 PCSK6(Proprotein convertase subtilisin/kexin-6)切割后才具有生物学活性。因此,Corin能否锚定到细胞膜上对其是否具有生物学功能至关重要。本课题旨在研究胞内段近膜区的氨基酸序列对corin蛋白在细胞膜的锚定与酶原激活的影响。研究方法:1.以小鼠野生型corin质粒mWT为模板,用VectorNTI软件设计引物,利用PCR 定点突变技术(QuikChange lightning site-directed mutagenesis kit)构建一系列胞内段截短型corin蛋白表达载体。2.将野生型及突变corin质粒转染人胚肾293细胞(Human embryonic kidney,HEK293),制备细胞裂解液,蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测重组corin蛋白在细胞中的表达及活化。3.用 Western blotting、免疫荧光染色(Immunofluorescent staining)和流式细胞术(Flow cytometric analysis)检测mWT corin蛋白及其突变体在细胞膜的表达。4.用胰蛋白酶(Trypsin)处理表达corin及其突变的HEK293细胞,Western blotting和流式细胞术分析Trypsin处理对细胞膜蛋白表达的影响。5.用overlap-PCR技术把分泌蛋白pro-ANP信号肽序列换成corin蛋白跨膜区构建表达载体TM,将corin蛋白的胞内段序列加到pro-ANP信号肽序列之前,构建表达载体TR,将TR的精氨酸突变成丙氨酸构建TA表达载体。流式细胞术检测pro-ANP在细胞膜上的表达,研究胞内段是否是质膜锚定信号。结果:1.我们将野生型corin mWT和活化位点突变质粒R868A转染HEK293细胞,培养24 h之后,加入Trypsin消化。Western blotting检测胞浆中corin的表达与活化,发现Trypsin消化之后野生型corin mWT活化条带corin-p明显减少。我们还用流式细胞术检测corin蛋白在细胞表面的阳性率,用Trypsin消化之后,corin mWT在细胞表面的阳性率显著降低(14.91 ±0.74%vs.48.84 ±2.16%,p<0.0001,n=5)。提示:Corin蛋白在细胞内合成之后,经过胞内修饰,最终以跨膜蛋白形式表达于细胞膜上。2.小鼠corin胞内段含有112个氨基酸,为了研究胞内段氨基酸序列对corin质膜锚定的影响,我们从氨基端依次去掉106个氨基酸,发现并未影响corin的表达与活化。说明,小鼠corin胞内段在仅有6个氨基酸时能锚定在细胞膜上并活化。3.构建corin胞内段截短型mD111(胞内段含有起始甲硫氨酸和近膜区的精氨酸)和mD112(胞内仅有起始甲硫氨酸),流式细胞术检测发现,mD111 corin在细胞膜上表达的阳性率与野生型mWT相比没有差异(56.69 ± 4.27%vs.53.37 ±1.61%,p=0.24,n=6),而 mD1 12 corin 几乎不在膜上表达(1.69±0.13%vs.53.37± 1.61%,p<0.0001,n=6)。Western blotting检测corin胞浆中表达与活化发现,mD111 corin可以表达,并且也可以被切割活化产生约40 kDa的活化片段(corin-p)。分析比较corin活化带,突变体mD1 11与野生型mWT相比没有显著差异(26.89 ± 2.35%vs.23.64 ± 3.28%,p=0.44,n=5),而在mD112 corin,检测到表达的corin酶原条带,但是未见活化片段corin-p。提示:小鼠corin蛋白胞内段仅仅需要一个精氨酸就足够可以把cori蛋白锚定到细胞膜上被活化。4.HEK293细胞中转染pro-ANP突变体(TM、TR和TA),流式细胞术检测pro-ANP在细胞表面的表达发现,TM、TA和TR均不能在细胞膜上表达,提示:近膜区的精氨酸并不是质膜锚定信号,不能使分泌蛋白变成跨膜蛋白。结论:小鼠corin蛋白胞内段第112位的精氨酸对corin的质膜锚定起到至关重要的作用,胞内段仅需一个精氨酸就足够将corin蛋白锚定到细胞膜上。第二章:Corin胞内段氨基酸电荷对跨膜构向的影响研究目的:我们发现corin胞内段第112位的精氨酸对其在细胞膜锚定与酶原激活起重要的作用,但是该精氨酸并不是corin在细胞膜的锚定信号,不能促使分泌蛋白pro-ANP变成跨膜蛋白。目前尚不明确小鼠corin第112位精氨酸如何与跨膜区序列一起在corin蛋白的细胞内转运以及细胞膜锚定过程中的作用。人们长期以来认为,膜蛋白的跨膜构向遵循“正电荷居内原则”(Positive-inside rule):即跨膜区两侧15个氨基酸所带的电荷总和决定跨膜构向,带正电荷的氨基酸主要分布在膜内侧。Corin是一种Ⅱ型跨膜蛋白,其氨基端胞内段近膜区是带正电荷氨基酸,按照“正电荷居内原则”,这些带正电荷的氨基酸决定了 corin蛋白的跨膜构向,即氨基端在细胞内,羧基端在细胞外。本章节我们拟构建近膜区电荷改变的corin突变体,探讨corin近膜区氨基酸的电荷是否遵循“正电荷居内原则”决定corin蛋白的跨膜构向。研究方法:1.以mD111 corin为模板,用Vector NTI软件设计引物,利用PCR定点突变技术将第112位精氨酸(Arg,R)分别突变成电中性的丙氨酸(Ala,A)、带负电荷的天冬氨酸(Asp,D)以及同样带正电荷的赖氨酸(Lys,K),构建截短型突变表达载体 D-R112A、D-R112D 和 D-R112K。2.以mWT corin为模板,将胞内段第112位R分别突变成A、D和K,构建corin全长序列突变表达载体R112A、R112D和R112K。3.将野生型和突变体corin质粒转染HEK293细胞,制备细胞裂解液,Western blotting检测corin蛋白在细胞浆内的表达及活化。4.将野生型和突变体corin质粒转染pro-ANP稳定表达的HEK293细胞系,Western blotting检测上清中pro-ANP的活化,探讨氨基酸突变对corin功能的影响。5.利用生物素(Biotin)标记细胞膜蛋白和流式细胞术检测corin突变体在细胞膜表面的表达。6.通过PNGase F(肽N-糖苷酶F)检测corin蛋白是否经过N-糖基化修饰。7.将野生型和突变体corin质粒转染HEK293细胞,48 h后收集细胞培养上清液,Western blotting检测corin蛋白在上清中的表达。结果:1.Western blotting检测细胞裂解液中corin的表达与活化,corin第112位正电荷的R突变成带负电荷的D或者不带电荷的A后,corin蛋白可以正常表达,但是几乎检测不到40kDa的活化片段corin-p。而R突变成同样带正电荷的K后,不影响活化片段的生成。用生物素标记和流式细胞术检测corin蛋白在细胞表面的表达,结果显示截短型corin突变体D-R112A和D-R112D不能在细胞膜上表达,而全长corin突变体R112A和R112D在细胞膜上弱阳性表达,而同样带正电荷的突变体D-R112K和R112K可表达于细胞膜。提示:近膜区的正电荷是corin蛋白在细胞膜锚定所必需的。2.野生型corin mWT、mD111和D-R112K均可使pro-ANP活化产生ANP,而mD112、D-R112A和D-R112D不能活化pro-ANP。提示:去掉第112位R或者将R突变成A/D,corin失去生物学功能。3.胞内段近膜区第112的R突变成电中性的A或者电负性的D时,按照“正电荷居内原则”,corin蛋白理论上可能会发生跨膜构向翻转。己知corin所有糖基化位点均位于羧基端胞外段,糖基化的酶位于内质网腔面,假如发生翻转,corin蛋白将不会有糖基化修饰,因此我们可以通过检测corin是否发生糖基化来判断corin蛋白是否翻转。Western blotting显示经过糖苷酶PNGase F处理之后,corin条带都明显变小,说明野生型与突变体corin都经过了糖基化修饰,表明D-R112A、D-R112D、R112A和R112D没有遵循“正电荷居内原则”,跨膜构向没有翻转。4.Western blotting检测corin及其突变体在细胞上清中的表达,发现去掉第112位R,即mD112,corin可以在上清中表达,提示去掉R之后,corin由原来的跨膜蛋白变成分泌蛋白,分泌到上清液中。同样,截短型corin电荷突变D-R112A和D-R112D也可以在上清中检测到。提示:截短型corin跨膜区内侧电荷改变,D-R112A和D-R112D corin由原来的跨膜蛋白变成分泌蛋白。结论:我们通过对corin胞内段近膜区第112位精氨酸进行突变,发现是近膜区的正电荷,而不是特定的氨基酸,是corin蛋白在细胞膜锚定所必需的。用糖苷酶PNGase F处理corin蛋白发现,野生型与突变体corin都经过了糖基化修饰,表明corin跨膜区内侧电荷改变,并不改变跨膜区的构向。在细胞培养上清中可检测到D-R112A和D-R112D corin的表达,提示:截短型corin跨膜区内侧电荷改变,corin由原来的跨膜蛋白转变成分泌蛋白。我们的研究结果提示:传统的“正电荷居内原则”可能并非是决定跨膜蛋白的构向。因此,corin胞内段近膜区带正电荷的氨基酸的生物学意义需要进一步阐明。第三章:胞内近膜区精氨酸对信号肽酶切割的影响研究目的:前文中我们发现,将corin跨膜区内侧氨基酸电荷改变,跨膜构向没有翻转,而corin由跨膜蛋白变成分泌蛋白,但其发生机制不明。对于分泌蛋白来讲,蛋白质首先在细胞质游离核糖体上起始合成,初生蛋白带有一段信号肽(Signal peptide,SP)序列,通过信号肽引导,肽链进入内质网膜,然后内质网腔面的信号肽酶(Signal peptidase)切除信号肽,进入内质网腔内的多肽链随即进行折叠及其他一系列修饰过程,经过高尔基体进一步加工修饰,形成成熟的蛋白,最终分泌到细胞外。本章节我们研究corin跨膜区内侧氨基酸电荷改变之后,corin由跨膜蛋白转变成分泌蛋白的过程中,是否有信号肽酶的参与以及参与的分子机制。研究方法:1.利用CRISPR-Cas9系统构建信号肽酶催化亚基SPC18(Signal peptidase complex 18)和 SPC21(Signal peptidase complex 21)基因敲除(Knockout,KO)的HEK293细胞系,并提取基因组DNA,PCR鉴定;提取蛋白,Western blotting鉴定。2.将野生型和突变体corin质粒转染HEK293、SPC18-KO与SPC21-KO细胞系,制备细胞裂解液,Western blotting检测corin蛋白在细胞浆内的表达及活化。3.将野生型和突变体corin质粒转染HEK293、SPC18-KO与SPC21-KO细胞系,48 h后收集细胞培养上清液,Western blotting检测corin蛋白在上清中的表达。4.利用流式细胞术检测corin突变体在细胞膜表面的表达。5.利用免疫荧光染色检测corin蛋白在细胞内的亚定位。结果:1.基因水平与蛋白水平鉴定显示,信号肽酶催化亚基SPC18-KO和SPC21-KO的HEK293细胞系中SPC18和SPC21基因敲除,无相应蛋白表达。2.将mD111和mD112转染KO细胞系,Western blotting检测corin在上清液中的表达。发现HEK293与SPC21-KO细胞系上清中都可以检测到mD112的表达,而SPC18-KO细胞系上清液中检测不到mD112的表达。提示:信号肽酶催化亚基SPC18可能参与mD112 corin的分泌过程。3.用流式细胞术检测mD112 corin在细胞膜上的表达,发现,HEK293与SPC18-KO细胞膜上都几乎检测不到mD112 corin的表达,说明SPC18基因敲除之后,mD112 corin不能锚定在细胞膜上。4.用免疫荧光染色检测mD112 corin的亚细胞定位,发现mD112 corin与GM130(高尔基体标记物)没有明显共定位,而与KDEL(内质网标记物)存在明显共定位。提示:信号肽酶催化亚基SPC18基因敲除之后,mD112 corin合成运输到内质网(Endoplasmic reticulum,ER)腔面,SPC18 不能切割 mD112 corin,使其滞留在ER中。5.将 D-R1 12A 和 D-R1 12D corin 质粒转染 SPC18-KO 细胞系,Western blotting检测上清液,发现,D-R112A和D-R112Dcorin分泌受阻。提示:催化亚基SPC18参与D-R112A和D-R112D corin的分泌过程。6.用流式细胞术检测D-R112A和D-R112D corin在细胞膜上的表达,发现,SPC18基因敲除之后,D-R112A和D-R112Dcorin不能锚定在细胞膜上。7.用免疫荧光染色检测D-R112A和D-R112D corin的亚细胞定位。在SPC18-KO细胞系中D-R112A和D-R112D corin与KDEL明显共定位。提示:信号肽酶催化亚基SPC18基因敲除之后,D-R112A和D-R112D corin合成运输到ER腔面,SPC18不能对其切割,使D-R112A和D-R112D corin滞留在ER中。这些结果与mD112 corin的结果一致。结论:我们发现当corin胞内段近膜区带正电荷的氨基酸改变后,corin由跨膜蛋白变成了分泌蛋白,在这一过程中,信号肽酶催化亚基SPC18参与corin蛋白切割和分泌,SPC18基因敲除之后,D-R112A和D-R112Dcorin滞留在ER中。综上所述,我们发现corin胞内段仅需要保留一个精氨酸就可以锚定到细胞膜上被活化,表明近膜区的正电荷对corin蛋白的细胞膜锚定至关重要。我们进一步探讨胞内近膜区精氨酸所起的作用,发现精氨酸不是遵循Von Heijine等于1980年代提出的“正电荷居内原则”决定corin的跨膜构向。我们的结果提示:当corin合成运输到内质网腔面时,胞内段近膜区的精氨酸所带的正电荷可以防止corin被信号肽酶切割,从而保证corin能够正常以跨膜蛋白进行转运、修饰,最终表达到细胞表面。当corin胞内近膜区电荷改变(R突变成A/D),这种保护机制丧失,导致信号肽酶催化亚基SPC18在ER腔面切割corin,使其成为分泌蛋白。如果SPC18敲除之后,corin蛋白则滞留在ER中。我们的这些实验结果表明,长期认可的“正电荷居内”决定膜蛋白跨膜构向的原则需要修正。我们首次提出,膜蛋白胞内段近膜区带正电荷的氨基酸不决定跨膜构向,而是作为一种保护机制,防止信号肽酶切割。