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椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IVDD)是一系列脊柱退变性疾病的病理学基础;由IVDD造成的椎间盘退变性疾病是以颈肩腰腿痛为主要表现的一系列临床综合征,为临床上的多发病、常见病之一。IVDD性疾病不仅给患者带来了巨大的痛苦,而且严重影响其生活质量及健康,还造成了巨大社会和家庭的经济负担。目前,在临床上主要通过保守或手术治疗的方法治疗IVDD性疾病来缓解其临床症状,并不能延缓、阻止或逆转IVDD病理进程,尚无理想的防治措施;因此探究IVDD的机制及减缓病程发展具有重大的意义。IVDD是一个非常复杂的多因素作用过程,其具体分子生物学机制仍然未被明确阐明。IVDD是以髓核细胞生存和损伤平衡为特点的,髓核细胞过度凋亡被认为是引起IVDD的一个重要原因,在IVDD发生发展过程中发挥重要作用。并且,髓核细胞的凋亡和数量减少会导致细胞外基质合成的减少,从而加速IVDD进程。目前研宄表明,炎症因子和IVDD之间存在密切联系;TNF-α作为最重要的炎症因子之一,可以诱导髓核细胞凋亡。微小RNAs(microRNAs,miRNAs/miR)是一种内生的非编码的由大约20-24核苷酸组成的单链小RNA,通过与靶mRNA的3’端非翻译区(untranslated region,UTR)的互补序列结合,从而抑制mRNA翻译过程,负向调控基因转录后水平,是基因的调节网络中是一个重要的组成部分。miRNAs参与调节体内正常细胞的多种生物学过程如生长、分化、增殖及凋亡。研究表明,miRNAs介导的转录后调控机制可影响IVDD进程。但是,miRNAs如何在炎症反应条件下参与调控髓核细胞凋亡的机制还未完全阐明。文献调研及总结发现miR-199可能参与细胞的凋亡,且通过其与下游靶基因(凋亡相关基因,如MAP3K5等)相互作用而实现。进一步采用生物信息学分析软件得出miR-199与MAP3K5存在互补结合序列。然而miR-199及MAP3K5在由肿瘤坏死因子-α(TNF-α)引起的髓核细胞凋亡机制未见报道。本研究通过对临床标本及细胞模型中TNF-α及miRNAs的检测与筛选,明确TNF-α作用下miRNAs在正常和退变椎间盘组织中差异表达,观察miR-199及TNF-α在IVDD发展过程中的关系。通过建立TNF-α诱导人椎间盘髓核细胞损伤模型,验证miR-199在TNF-α诱导人髓核细胞凋亡中的作用,进一步预测其靶基因并阐明miR-199在TNF-α诱导人髓核细胞凋亡中的生物学作用及其分子生物学机制,从而为IVDD的早期诊断提供敏感、特异的新型分子诊断标志物,为IVDD的早期诊治提供科学依据。第一部分人体椎间盘髓核组织中TNF-α及miRNAs表达的研究目的:通过分析TNF-α及miRNAs在正常及IVDD髓核组织中的差异性表达,探讨TNF-α及miRNAs在IVDD中的关系。方法:收集河北医科大学第三医院5例IVDD病人髓核标本及5例年青脊柱爆裂骨折患者正常髓核标本,高通量分析筛选两组样本中差异性表达的miRNAs,通过ELISA技术检测两组样本TNF-α水平变化。结果:高通量分析筛选出2组的椎间盘髓核细胞中差异表达miRNAs中共30个,其中表达下调18个(miR-199、miR-502、miR-203等),上调12个(miR-33b、miR-451、miR-22等),其中miR-199差异表达较大(Fold change>2)。与人正常椎间盘髓核组织相比,TNF-α在退变的椎间盘髓核组织中表达明显升高,其差异具有统计学意义(P<0.05)。小结:通过高通量检测筛选及qRT-PCR证实:与正常椎间盘髓核组织相比,退变椎间盘髓核组织中miR-199表达明显下调。与正常椎间盘髓核组织相比,TNF-α在退变椎间盘髓核组织较中的表达水平明显升高。TNF-α及miR-199表达变化说明其与IVDD有密切的联系,可能参与了IVDD发生于发展。第二部分体外研究TNF-α对人髓核细胞miRNAs表达及凋亡的影响目的:体外建立TNF-α诱导人椎间盘髓核细胞损伤(凋亡)模型,高通量分析筛选正常及损伤(凋亡)髓核细胞中miRNAs的差异性表达及分子生物学验证,并探讨miR-199对人髓核细胞损伤的影响。方法:体外培养人椎间盘髓核细胞株,应用同浓度TNF-α(50ng/ml)刺激髓核细胞,在0h,8h,16h,24h,48h时间点收集细胞后使用MTT检测细胞活性、通过ELISA技术测定LDH活性、qRT-PCR技术检测miR-199表达量;并将收集的正常对照及损伤髓核细胞(TNF-α刺激24h)裂解后做miRNAs高通量分析筛查。利用带有miR-control、miR-199、anti-miR-control及anti-miR-199腺病毒载体转染人髓核细胞,应用qRTPCR技术检测转染后的髓核细胞及空白对照组miR-199表达量。给予人髓核细胞miR-199及anti-miR-199腺病毒载体转染,监测在TNF-α作用下细胞活性、LDH活性、细胞凋亡(TUNEL、Bax、Bcl-2、caspase-3及Cleaved-caspase-3表达)变化,进一步阐明TNF-α刺激的人髓核细胞中miR-199的潜在作用。结果:高通量分析筛选正常培养及TNF-α干预后人椎间盘髓核细胞中miRNAs的表达差异:共筛选出30个,其中表达上调18个(miR-199、miR-224、miR-223等),下调12个(miR-33b、miR-498、miR-1983等),其中miR-199差异表达较大。人髓核细胞活性及miR-199表达量随着TNF-α刺激时间的增加而明显下降(P<0.05),LDH活性随TNF-α刺激时间的增加而明显增加(P<0.05),LDH活性、细胞活性及miR-199表达在TNF-α干预后24h及48h无明显差异。人的椎间盘髓核细胞用miR-199重组腺病毒转染后miR-199表达明显增加,anti-miR-199腺病毒转染后可逆转miR-199的表达(P<0.05)。TNF-α刺激组较对照组细胞活性明显下降(P<0.05),LDH活性明显升高(P<0.05),细胞凋亡率明显增加(P<0.05),Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-3表达水平及Bax/Bcl-2呈明显增加(P<0.05);anti-miR-199组较TNF-α刺激组细胞活性明显下降(P<0.05),LDH活性明显升高(P<0.05),细胞凋亡率明显增加(P<0.05),Bax、Bcl-2、Cleavedcaspase-3表达水平及Bax/Bcl-2呈明显增加(P<0.05),miR-199过表达可逆转上述现象。小结:本部分研究证实TNF-α可以诱导髓核细胞凋亡,且呈时间依赖性,同时证实退变髓核细胞中miR-199差异表达明显,提示miR-199可能参与了IVDD的发病过程。明确TNF-α干预可下调人的椎间盘髓核细胞中miR-199表达,进而诱导细胞的凋亡,由此推断miR-199可能是TNF-α诱导髓核细胞凋亡的关键靶点。第三部分miR-199靶基因预测、验证及作用机制研究目的:预测并验证miR-199与其靶基因MAP3K5的相互关系及作用机制,进一步明确miR-199在TNF-α诱导人椎间盘髓核细胞的凋亡过程中作用。方法:应用DIANA生物信息学软件对miR-199的靶基因进行预测;确定靶基因后,通过双荧光素酶报告基因分析进一步验证miR-199与靶基因的相互作用。具体通过实验探讨miR-199与其靶基因MAP3K5的靶向调节关系及潜在分子生物学作用机制。利用带有miR-control、miR-199、anti-miR-control及anti-miR-199重组腺病毒载体转染人髓核细胞,通过qRT-PCR及Western-blot技术检测MAP3K5的mRNA与蛋白的表达水平;同时检测TNF-α刺激组及对照组的MAP3K5的mRNA与蛋白的表达水平。进一步将miR-control、miR-199的重组腺病毒载体与MAP3K5过表达或空白质粒载体共同转染髓核细胞,监测在TNF-α作用下,MAP3K5 mRNA与蛋白的表达水平、细胞及LDH活性、细胞凋亡比率及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3及Cleaved-caspase-3表达水平。结果:DIANA生物信息学软件预测分析得出MAP3K5是miR-199重要靶基因,且在TNF-α诱导人椎间盘髓核细胞损伤中发挥重要作用。双荧光素酶报告分析显示:miR-199可作用于MAP3K5 mRNA的3’-UTR抑制其表达。miR-199转染髓核细胞中MAP3K5 mRNA及MAP3K5蛋白表达水平较对照组明显降低(P<0.05),而anti-miR-199组明显增高(P<0.05)。较正常对照组,TNF-α刺激组的MAP3K5的mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。在TNF-α刺激作用下miR-199+NC组的人髓核细胞MAP3K5的mRNA及蛋白表达量明显低于对照组(P<0.05),而miR-199+MAP3K5过表达组较miR-199+NC组的MAP3K5的mRNA及蛋白表达量明显增高(P<0.05)。在TNF-α作用下miR-199+NC组较对照组细胞活性增高、LDH活性降低、细胞凋亡率及凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-3)表达水平明显降低(P<0.05),而miR-199+MAP3K5组较miR-199+NC组结果正相反(P<0.05)。小结:生物信息学预测及双荧素酶报告基因系统及Western blot方法证实MAP3K5是miR-199的靶基因,并且miR-199抑制MAP3K5表达通过结合其3’-UTR实现。由此证实miR-199通过靶向MAP3K5调节由TNF-α诱导的人髓核细胞的凋亡。