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目的：本实验通过分离健康人外周血单个核细胞,应用不同的细胞因子体外诱导分化出树突状细胞(Dendritic Cells, DC)和细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-induced killer cells, CIK)细胞,将冻融抗原(Antigen, Ag)致敏DC并与CIK细胞共培养。(1)观察视网膜母细胞瘤(Retinoblasotma, RB)细胞株RB-Y79细胞冻融抗原致敏的DC与CIK细胞共培养后,DC与CIK细胞的形态学改变、细胞表型以及细胞增殖情况的变化；(2)探讨冻融抗原致敏的DC-CIK细胞(DC-Ag-CIK细胞)对RB-Y79细胞的杀伤作用以及联合应用卡铂后对RB-Y79细胞的协同杀伤作用。(3)探讨DC-Ag-CIK细胞联合卡铂对RB-Y79细胞可能的杀伤机制。方法：(1)观察冻融抗原致敏的DC与CIK细胞的体外增殖与生物学活性。取健康人外周血单个核细胞,加入不同细胞因子培养DC及CIK细胞,第3天用RB-Y79细胞冻融抗原致敏DC并于第7天将DC与CIK共培养,分为CIK组, DC-CIK组和DC-Ag-CIK组。第7天倒置显微镜下观察DC及CIK细胞形态,以及3组细胞在共培养后的增殖情况。流式细胞仪检测DC第3、7天及CIK细胞第7、15天的细胞表型变化。CBA细胞因子试剂盒检测共培养至第15天时3组细胞上清液中IL-6及IL-10的含量。(2)检测杀瘤活性。PI法检测卡铂对RB-Y79及hTERT-RPE1细胞的杀伤活性；CFSE/PI法检测效应细胞(CIK、DC-CIK及DC-Ag-CIK细胞)在不同效靶比下对RB-Y79细胞、hTERT-RPE1细胞(正常视网膜色素上皮细胞)、RB耐药细胞(RB-resistant cells, RB-R)的杀伤作用,以及效应细胞联合卡铂对RB-Y79细胞的杀伤作用和CIK细胞在不同培养液条件下对RB-Y79细胞的杀伤活性; CFSE/PI法检测卡铂与DC-Ag-CIK细胞在不同应用顺序下对RB-Y79细胞的杀伤作用。(3)在RB-Y79细胞上转染GFP绿色荧光蛋白并筛选出RB-GFP细胞,免疫荧光显微镜拍摄卡铂和／或DC-Ag-CIK细胞对RB-GFP细胞的动态杀瘤过程；免疫荧光染色法及流式细胞术检测卡铂和／或DC-Ag-CIK细胞作用RB细胞后,RB细胞膜外Annexin V蛋白的表达情况。结果：(1)经过培养的DC呈现出典型的“树突状”结构,CIK细胞则聚集成团。培养至第15天时,DC-Ag-CIK和DC-CIK组的细胞数绝对值明显高于CIK组(P<0.01),DC-CIK组与DC-Ag-CIK组的IL-6含量明显高于CIK组,而DC-Ag-CIK组IL-10含量明显低于CIK组与DC-CIK组(P<0.01)。经过7天的培养,DC细胞表型CD80、CD83、CD86的表达率均明显高于第3天时的DC细胞(P<0.01)。第15天的各组CIK细胞的细胞表型均明显高于第7天未与DC共培养时的CIK细胞(P<0.01),而在第15天的CIK组、DC-CIK组及Ag-DC-CIK组中,Ag-DC-CIK组的CD3+CD56+及CD3+CD8+表达率均明显高于CIK组及DC-CIK组(P<0.01)。(2)效应细胞随着效靶比的增高对RB-Y79细胞的杀伤活性也随之增高,在相同效靶比下,Ag-DC-CIK细胞对RB-Y79细胞的杀伤活性明显高于CIK组与DC-CIK组(P<0.05)；效应细胞对正常视网膜色素上皮细胞hTERT-RPE1细胞几乎没有杀伤作用,且各组效应细胞之间没有明显差异(P>0.05)；CIK细胞在三种不同培养液条件下对RB-Y79细胞的杀伤活性无明显差异(P>0.05)；在效应细胞与卡铂联合作用后,在相同效靶比的条件下对RB-Y79细胞的杀伤活性明显高于单独应用效应细胞和单独应用卡铂(P<0.01),同时对RB耐药细胞的杀伤活性也明显高于单独应用效应细胞(P<0.01)；在两次卡铂中加入应用DC-Ag-CIK细胞后,其杀瘤率高(71.16±4.65%),与其他各组相比具有非常显著的统计学差异(P<0.01)。(3)当RB-GFP细胞死亡时,RB细胞的绿色荧光消失,同时变被PI染成红色。RB细胞预先与卡铂共培养12小时后再加入DC-Ag-CIK细胞,其出现RB凋亡细胞比单独应用卡铂及单独应用DC-Ag-CIK细胞需较短的时间；DC-Ag-CIK组Annexin V阳性细胞表达率明显高于CIK组及DC-CIK组(P<0.01),与CIK细胞组相比,DC-Ag-CIK细胞能引发更多的RB凋亡细胞(P<0.01),卡铂联合DC-Ag-CIK细胞后,其引发RB凋亡细胞数明显多于DC-Ag-CIK组及单独卡铂组(P<0.01)。结论：(1)RB冻融抗原致敏的DC与CIK细胞共培养后,可促进DC及CIK细胞的成熟与分化,使CIK细胞具有更强的增殖活性,并与IL-6的分泌上调以及IL-10的分泌下调有关。(2)RB冻融抗原致敏的DC可增强CIK细胞对RB-Y79细胞的特异性杀伤作用,可能由于DC-Ag与CIK细胞共培养后可使CIK细胞大量增殖并诱导出大量CD3+CD56+的T细胞,从而提高了杀瘤活性。而DC-Ag-CIK细胞对正常视网膜色素上皮细胞(hTERT-RPE1细胞)无明显杀伤作用。(3)效应细胞联合卡铂后对RB-Y79细胞及RB-R细胞均可产生明显的协同杀伤作用,DC-Ag-CIK细胞联合低剂量的卡铂对RB-Y79细胞仍可产生明显的杀瘤效果。(4)卡铂联合DC-Ag-CIK细胞后能缩短杀瘤时间,其杀瘤机制可能是通过增加诱导RB细胞出现早期凋亡。