为了适应周围的环境,地球上所有的生物从原核生物到人类都具有与昼夜周期近似的生活节律,这种节律通过昼夜节律生物钟基因(circadian clock genes)之间形成的转录翻译反馈环路来实现。哺乳动物的生物钟中枢位于下丘脑视上核(Supraoptic nucleus, SCN),下丘脑视上核的神经元细胞节律性地释放各种生物信号以保证机体生理活动能趋于同步、有序进行。钟基因通过调节下游的钟控基因(clock controlled genes,CCGs)调节各项生理功能,不仅表现在觉醒、摄食等自主活动上,也表现在免疫、体温调节等基本生理活动上。如果因为某种原因,生物的这种昼夜节律被打乱,就会致病甚至被环境淘汰。长期倒班工作或睡眠不规律会引起昼夜节律紊乱和代谢失常,导致以心血管疾病为代表的多种疾病的发病率升高、发病年龄提前。虽然近年来关于能量代谢相关性疾病发生与生物钟的研究以及关于光照对实验动物生物钟基因表达影响的研究越来越多,但尚未有专门针对生物钟紊乱小鼠动脉粥样硬化模型的关于脂质代谢与生物钟紊乱的研究报道。因此我们通过改变外界光照环境建立了昼夜节律生物钟紊乱的小鼠动脉粥样硬化模型,并检测5种生物钟基因、4种受生物钟调节的脂质代谢相关基因在不同组织内24小时表达的动态变化。NAD依赖的脱乙酰基酶-1(NAD-dependent deacetylase sirtuin-1, SIRT1)一方面在饥饿时促进糖异生、脂解作用、调节脂肪细胞分化、促进胰岛素分泌增强组织对胰岛素的敏感性,稳定机体脂质代谢；另一方面可以清除活性氧、抑制内皮依赖的血管收缩、调节转录调节因子包括p53,PML以(promyelocytic leukemia protein), FoxO(fork-head box O), NF-κ B(nuclear factor κ B)及PPAR-γ (peroxisome proliferators-activated receptor-γ)的表达参与细胞衰老和凋亡、通过NF-κB信号途径下调促炎因子发挥抗炎作用、减少巨噬细胞对氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)的摄取及促进斑块巨噬细胞内胆固醇反向转运、抑制内皮组织因子(coagulation factor Ⅲ)的表达发挥抗血栓作用从而在动脉粥样硬化的发生发展过程中对血管起保护作用。最近研究发现,SIRT1通过脱乙酰作用对CLOCK-BMAL1异二聚体进行功能调控,还能活化过氧化物酶体增殖活化受体共活化物-1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPAR-γ) coactivator-1β, PGC-1α)增强RORα对REV-ERB α的激活作用从而在能量代谢与昼夜节律生物钟之间建立了功能水平和分子水平上的联系。所以我们同时还检测了不同组小鼠四种组织中sirtl基因的表达,通过观察动脉粥样硬化小鼠24小时内sirtl基因表达的动态变化,来研究sirtl基因表达节律改变在脂质代谢异常及动脉粥样硬化发生发展中的作用。最后我们进一步研究了H2S对小鼠肝脏细胞昼夜节律的影响,从而探讨能量代谢改变与小鼠生物钟紊乱之间的联系。第一部分：生物节律紊乱动脉粥样硬化小鼠中钟基因、脂质代谢相关基因的改变目的：观察昼夜节律紊乱的小鼠动脉粥样硬化模型中生物钟基因以及脂质代谢相关基因表达的改变,并探讨其机制。方法：采用apoE-/-小鼠(C57BL/6J来源)和C57BL/6J小鼠通过光照变化建立生物节律紊乱的动脉粥样硬化小鼠模型。用6周龄的apoE-/-雄性小鼠24只,分为两组,一组给予普通膳食,另一组西方类型膳(含有0.15%胆固醇和21%脂肪)；以24只C57BL/6J雄性同龄小鼠作对照,同样分为两组饲养。所有小鼠均给予12小时光照12小时黑暗两周、12小时黑暗12小时光照两周、12小时光照12小时黑暗两周(12L/12D2w,12D/12L2w,12L/12D2w),共6周的不规律光照,导致小鼠昼夜节律紊乱。记录各组小鼠实验前后体重变化；根据Zeitgeber Time(给予光照时刻记为ZT0),分别在ZT0(8am)、ZT4(12am)、ZT8(4pm)、ZT12(8pm)、ZT16(0am)、ZT20(4am)6个时间点处死小鼠,摘眼球取血制备血清,检测血清葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白含量；取小鼠主动脉弓做冰冻切片,油红O染色检测动脉粥样斑块；取小鼠的心脏、肝脏、下丘脑和附睾脂肪挚液氮速冻保存于-70℃。利用Real-time PCR检测不同组小鼠四种组织中生物钟基因mClock、mBmal1、mPer2、mCry1、mRev-erbα和脂质代谢相关基因ppar α、ppar γ、ror α、rxr γ、以及sirtl基因表达的动态变化。结果：经过六周的光照刺激(12L/12D2w,12D/12L2w,12L/12D2w),给予西方类型膳的apoE-/-小鼠主动脉弓处可见明显的粥样易损斑块(脂质池大、纤维帽薄、内皮部分剥脱表面有血小板聚集),且血清葡萄糖、总胆固醇以及低密度脂蛋白均高于普食饲养组。普食饲养的apoE-/-小鼠也可见粥样斑块形成但斑块脂质核小,纤维帽厚,斑块表面内皮完整,纤维帽肩部平滑。西方类型膳饲养的C57BL/6J小鼠仅可见内膜下少量脂质沉积和泡沫细胞形成,血清葡萄糖、总胆固醇以及低密度脂蛋白均高于普食饲养组。普食饲养的C57BL/6J小鼠血管内未见到明显病理变化。Real-time PCR结果显示在正常小鼠中恒定表达的mClock基因在apoE-/-敲除小鼠肝脏、下丘脑中的表达量明显高于C57BL/6J组小鼠,在心脏和脂肪组织中的表达明显低于C57BL/6J组小鼠。其他钟基因mBmal1、 mPer2、mCry1、mRev-erb α的表达均表现出昼夜节律性,但是apoE-/-小鼠与C57BL/6J组小鼠之间节律的振幅以及相位明显不同,除mCry1在心脏的表达振幅C57BL/6J小鼠高于apoE-/-小鼠,其它基因在4种组织中的表达振幅均apoE-/-小鼠高于C57BL/6J小鼠。脂质代谢相关基因的表达也表现出了昼夜节律性,且有ppar α在apoE-/-小鼠4种组织的总表达量和昼夜节律振幅明显大于C57BL/6J小鼠。Pparγ除下丘脑中各组间差异不明显,在C57BL/6J小鼠心脏和肝脏中总表达量和昼夜节律振幅大于apoE-/-小鼠,脂肪组织中则相反。Sirtl基因在apoE-/-小鼠外周组织及C57BL/6J小鼠下丘脑均表现出节律性。同时我们还发现动脉粥样硬化的apoE-/-小鼠心脏中sirtl基因昼低夜高的表达节律发生了相位改变,而在中枢sirtl基因表达振幅随血管病变严重程度的增加而减小。第二部分：H2S对肝细胞生物钟基因表达节律的影响目的：观察H2S对肝细胞钟基因表达昼夜节律的影响方法：研究发现外周组织中存在独立于SCN的生物振荡器,但具体分布仍然没有明确。我们在前期试验中发现离体培养小鼠心肌细胞内生物钟基因表达的昼夜节律性能够保持2～3天,说明外周组织中的生物钟基因表达可以独立地产生节律性震荡。肝脏是脂质代谢的重要器官,感受内环境中的能量和激素信号,调节脂肪酸β氧化,脂蛋白摄取及释放,同时肝细胞表达所有已知的钟基因,脂质代谢相关基因亦节律性表达。我们在第一部分研究中发现sirtl基因表达节律的改变与小鼠脂质代谢紊乱及动脉粥样硬化的发生有关,有研究报道SIRT1蛋白的脱乙酰作用依赖细胞质内的NAD+/NADH比例,而H2S是具有血管保护作用的内源性还原物质能够影响NAD+/NADH比例。因此,为了单独研究外周生物钟基因的作用模式,我们选择原代肝细胞,通过血清休克的方法诱导其产生昼夜节律。具体方法为,通过肝脏灌注胶原酶Ⅳ的方法,取8周龄C57BL/6J小鼠的肝细胞,分为H2S组和对照组进行体外培养,血清休克后每4小时收一次细胞共观察68小时,通过Real-time PCR的方法检测生物钟基因mClock、mBmal1、 mPer2、mRev-erb α表达节律的改变。结果：对照组中,mClock基因没有明显的节律性,表达量随时间推移而逐渐减少；mPer2、mBmall以及mRev-erb a基因均表现出近24小时的节律性,但振幅和表达量逐渐减少。其中Bmal1基因的表达从ZT0点(根据Zeitgaber Time.血清休克的时间记为ZT0)即表现出了节律性；mPer2基因从ZT4开始出现节律性表达,mRev-erb α基因的表达从ZT8点开始表现出节律性,三种基因的节律性均可维持到实验结束。加入外源性H2S后,4种基因在48小时内的总表达量均高于对照组,且mBmal1和mRev-erb a基因的震荡幅度明显大于对照组。结论：一、通过改变光照和高脂饲养建立了昼夜节律生物钟紊乱的小鼠动脉粥样硬化模型。发现在生物钟紊乱的动脉粥样硬化小鼠中,肝脏和下丘脑中mClock基因24小时总表达量升高,而在心脏中相反,在脂肪组织中表现为峰值移位振幅增大。此外mBmal1, mPer2, mRev-erb a基因相位改变明显。并且以上生物钟基因的改变可以影响脂质代谢相关基因ppars, rxr-γ, ror-α表达水平以及昼夜节律的相位和振幅,这可能是长期倒班,时差综合征等容易引起代谢综合征的原因之一。小鼠生物钟中枢(下丘脑视上核)sirtl基因表达振幅减小程度与动脉粥样硬化血管损伤程度呈正相关；小鼠心血管系统中sirtl基因表达高峰移位,尤其是凌晨表达量减少,可能是导致动脉粥样硬化斑块容易在凌晨破裂的原因。二、通过血清休克方法建立了周期性表达昼夜节律生物钟基因的小鼠肝细胞模型。对照组肝细胞中,各种生物钟基因的表达均表现出近24小时的昼夜节律性,且表达量和峰值随时间推移逐渐减小。H2S可以在48小时内维持mClock,mPer2,mBmal1以及mRev-erb a的表达量和震动幅度,这说明外源性还原剂H2S对离体肝细胞生物钟基因昼夜节律的维持有保护作用,考虑是通过改变细胞内NAD+/NADH比例,增强SIRT1蛋白的活性实现的,具体机制还有待进一步研究。