【摘 要】
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目的:研究Kindlin-2在膀胱癌（Bladder cancer,BCa）组织中的表达情况,分析其表达与临床病理特征的相关性及对预后的影响;研究Kindlin-2对BCa细胞增殖、侵袭迁移等恶性表征的影响,并揭示其可能的作用机制。方法:1)收集185例BCa患者的组织标本,采用免疫组化（IHC）方法检测Kindlin-2在BCa组织、癌旁组织中的表达水平,分析其与临床分期、病理分级、肿瘤数量及复
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目的:研究Kindlin-2在膀胱癌（Bladder cancer,BCa）组织中的表达情况,分析其表达与临床病理特征的相关性及对预后的影响;研究Kindlin-2对BCa细胞增殖、侵袭迁移等恶性表征的影响,并揭示其可能的作用机制。方法:1)收集185例BCa患者的组织标本,采用免疫组化（IHC）方法检测Kindlin-2在BCa组织、癌旁组织中的表达水平,分析其与临床分期、病理分级、肿瘤数量及复发的关系。2)使用The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库分析BCa组织中Kindlin-2的表达情况,运用Kaplan-Meier生存分析工具评估Kindlin-2对BCa患者临床预后的影响。3)通过q RT-PCR（Quantitative real time PCR）和Western blot检测Kindlin-2在BCa细胞株中的表达水平,通过慢病毒转染Kindlin-2短发夹RNA（sh Kindlin-2）构建敲低Kindlin-2的BCa细胞株T24和5637。通过CCK-8实验、划痕实验、Transwell侵袭、裸鼠成瘤等体内外实验,研究Kindlin-2对BCa的生长、迁移和侵袭的作用。4)通过Western blot方法分析Kindlin-2调控Wnt/β-catenin信号通路中关键分子GSK3β、β-catenin的表达情况,免疫共沉淀（Co-IP）方法检测Kindlin-2与GSK3β蛋白的相互作用,进一步检测Wnt信号通路下游分子S期激酶相关蛋白2（Skp2）和p27蛋白表达情况,并通过挽救实验验证Wnt/β-catenin信号级联Skp2-p27通路能否调控BCa的进展。结果:1)IHC结果显示BCa组织中Kindlin-2的表达水平高于癌旁组织,且Kindlin-2的表达水平随着BCa临床分期、病理分级的增加而升高（P<0.001）。2)信息学分析显示随着临床分期的增加,Kindlin-2的转录水平明显上升（P<0.001）,Kaplan-Meier生存曲线显示与Kindlin-2低表达组相比,Kindlin-2高表达的BCa患者生存期更短（P<0.001）。3)q RT-PCR及Western blot结果显示,Kindlin-2在多种BCa细胞株中的表达明显高于膀胱尿路上皮细胞株SV-HUC-1（P<0.05）。体外CCK-8实验表明Kindlin-2敲低的BCa T24和5637细胞的增殖能力明显降低（P<0.01）,划痕实验、Transwell侵袭实验表明Kindlin-2敲低的T24、5637细胞株迁移能力和侵袭能力均低于对照组（P<0.01）。裸鼠成瘤实验发现Kindlin-2敲低组的肿瘤质量和体积均低于对照组（P<0.01）,移植瘤Ki-67表达阳性率Kindlin-2敲低组较对照组更低（P<0.001）。4)Western blot及Co-IP结果显示,Kindlin-2可直接结合GSK3β并促进其磷酸化,导致β-catenin表达上调而激活Wnt信号通路,进而上调Wnt通路下游分子Skp2蛋白的表达而抑制p27蛋白的表达。挽救实验表明Wnt/β-catenin通路激动剂氯化锂（Li Cl）可逆转Kindlin-2敲减的BCa细胞中的β-catenin水平及靶基因Skp2的表达,Kindlin-2表达敲减的BCa细胞p27被抑制后,细胞的存活能力及迁移能力得到一定程度的恢复。结论:1)Kindlin-2在BCa组织中表达上调,与BCa恶性程度呈正相关,可作为判断BCa患者预后的标志分子。2)Kindlin-2参与促进BCa细胞体外和体内增殖,促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。3)Kindlin-2通过直接结合GSK3β激活Wnt/β-catenin信号级联Skp2-p27通路促进BCa的进展。
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