论文部分内容阅读
脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)是由炎症、感染、外伤等引起的脊髓功能丧失,临床主要表现为运动感觉功能障碍、尿便障碍、神经痛等。脊髓损伤的发生率不高,却具有高致残率、高死亡率、高医疗负担的特点。因此,探索SCI病理机制和治疗措施对于脊髓损伤患者病情康复及回归社会生活尤为重要。大量研究表明,在脊髓损伤中骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)能够通过分泌神经营养因子、抑制炎症反应、直接分化为神经细胞等多种方式发挥神经保护作用。然而,MSC的治疗仍具有诸多局限性,包括生存率低,可能的肿瘤形成,免疫排斥和遗传变异等。越来越多的证据表明,间充质干细胞来源的的外泌体可以替代MSC移植,在不同疾病模型中表现出相似的神经保护作用。然而,骨髓间充质干细胞来源的外泌体骨髓间充质干细胞(Exosomes derived from Bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC-EXOs)在脊髓损伤中发挥的治疗作用及分子机制尚需进一步研究和阐述。周细胞,又被称为壁细胞,覆盖全身大部分血管壁的微血管内皮细胞,并插入微血管基底膜上。周细胞作为神经血管单元的核心部分发挥多种重要作用,包括:调节血脊髓屏障(Blood spinal cord barrier,BSCB)/血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)通透性;(2)调节毛细血管血流、血管系统的发育和维持;(3)清除有毒分子;(4)调节免疫细胞进入中枢神经系统;(5)在某些情况下表现出干细胞特性。研究发现脊髓损伤后周细胞丢失增加BSCB的通透性,直接导致微循环系统的破坏和有害血液成分的渗漏。细胞焦亡是一种新的程序性细胞死亡形式,其依赖于胱天蛋白酶1、4、5和11的激活并诱导促炎细胞因子的释放。最近一项研究发现由盲肠结扎和穿刺诱发的脓毒症动物模型中,周细胞焦亡而非凋亡会导致微血管渗漏。因此,在SCI模型中是否存在周细胞焦亡以及其对BSCB通透性的影响值得进一步探索。本课题基于对既往研究的总结分析,进一步探究脊髓损伤后病理改变以及骨髓间充质干细胞来源的外泌在脊髓损伤中的作用和潜在机制。目的:本研究旨研究间充质干细胞来源的外泌体对大鼠脊髓损伤治疗作用和潜在机制。研究方法:1.超速离心法提取外泌体,透射电镜下观察间充质干细胞来源的外泌体,外泌体样本由滴染法和漂浮法两种方法制成。粒径分析观察外泌体大小分布。WB检测外泌体特异性分子标记物CD9,CD63,和CD81。2.标准脊髓打击器制备脊髓损伤模型,实验共分为4组,Sham组、EXO组、SCI组、SCI+EXO组,脊髓损伤或假手术后30min及1天,EXO组和SCI组给予尾静脉注射外泌体悬液处理,其他组给予同等体积的PBS。3.应用尼氏染色和FJB染色评估脊髓损伤部位神经元存活;应用LFB染色和NF-200染色评估脊髓损伤后神经纤维数量。BBB评分用于评估脊髓损伤后大鼠运动功能恢复程度。4.伊文思蓝染色和水含量分别用于评估血脊髓屏障完整性和脊髓水肿程度。5.Elisa法用于测定炎症因子Il-1β和I1-18含量。6.免疫荧光双标用于分析周细胞焦亡和周细胞/内皮细胞覆盖率。结果:1.扫描电镜下可见大量双凹圆盘状外泌体,由漂浮法制作的外泌体样本较滴染法更能呈现外泌体的立体形态。粒径分析显示外泌体粒子大小多居于100nm左右。WB检测出外泌体特异性分子标记物CD9,CD63和CD81。2.尼氏染色和FJB染色显示外泌体疗法显著改善脊髓损伤后神经元存活。LFB染色和NF-200免疫组化染色显示外泌体疗法显著抑制脊髓损伤后神经纤维退化。BBB评分提示脊髓损伤后第14天、21天、28天,与SCI组相比,SCI+EXO组BBB评分明显升高(P<0.05),即从脊髓损伤后2周开始,外泌体疗法明显改善大鼠运动功能恢复。3.EB染色定性及定量均提示脊髓损伤后血脊髓屏障完整性遭到破坏,水含量结果提示脊髓损伤后脊髓水肿程度。与SCI组相比,SCI+EXO组脊髓损伤后的血脊髓屏障破坏程度和组织水肿明显减轻,差异有统计学意义(P<0.05)。4.WB结果和Elisa结果显示脊髓损伤组焦亡发生,炎症因子Il-1β和I1-18含量增加,Pdgfr-β和caspase-1双标结果提示脊髓损伤后周细胞存在焦亡,Pdgfr-β和Cd31结果提示脊髓损伤后周细胞大量丢失,周细胞/内皮细胞覆盖率明显降低。与SCI组相比,SCI+EXO组中,外泌体疗法能够抑制炎症因子产生和周细胞的焦亡,提高周细胞/内皮细胞覆盖率,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:骨髓间充质干细胞来源的外泌体能够有效抑制脊髓损伤后炎症因子释放,抑制周细胞焦亡,保护血脊髓屏障完整性,从而减少神经元死亡、神经纤维变性,促进实验动物运动功能恢复等。