论文部分内容阅读
多倍化是物种进化的一种重要表现形式,从进化角度而言多倍体水稻因有利基因组合机率增加,具有潜在的抗逆性和产量的双重优势,但是多倍体水稻因基因剂量的加倍导致其减数分裂紊乱,花粉育性和结实率大幅降低,因此提高其结实率是多倍体育种取得突破的关键。本实验室在利用远缘杂交和多倍体化双重优势选育超级稻的思想指导下,成功选育出两个减数分裂稳定的PMeS(polyploid meiosis stable,PMeS)多倍体水稻品系,该品系结实率高且能遗传稳定。OsMND1基因是酵母减数分裂相关的MND1(meiotic nuclear divisions 1)基因在水稻中的同源基因,与拟南芥的MND·1基因同源性也很高,在酵母和拟南芥的减数分裂中,该基因在同源染色体配对、联会和重组中有非常重要的作用。目前该基因在多倍体水稻未见其功能的详细报道。减数分裂在维持基因组稳定和重组创造遗传多样性发挥至关重要的作用,因此以OsMND1为切入点,开展其对PMeS(polyploid meiosisstable,PMeS)多倍体水稻减数分裂的调控机制研究具有重要意义。前期已经完成了对OsMND1基因的克隆、OsMND1干扰和超量表大载体的构建,并获得了转基因植株OsMND1超量表达的BLL-2x和OsMND1干扰的转基因植株DHN。本实验以水稻OsMND1超量表达的BLL-2x、PMeS品系HN-4x、OsMND1干扰的转基因植株DHN、非PMeS品系BLL-4x为实验材料,主要完成的实验内容如下:1)通过生物信息学预测该基因没有跨膜结构域,没有信号肽,具有螺旋-螺旋结构说明该基因不属于分泌蛋白,且与其他基因之间具有相互作用。通过BLAST比较OsMND1与酵母中MND1的DNA同源性高达49.7%,蛋白质同源性达41.7%,与其它很多植物中的蛋白同源性都在70%以上,进化树分析说明该基因在生物体内是非常保守的。在启动子预测中发现组织特异性相关的顺式作用元件较多,对OyMND1在PMeS品系HN2026-4x中进行组织特异性表达模式分析发现该基因主要在减数分裂幼穗和胚中表达,而幼穗和胚是减数分裂比较旺盛的部位。亚细胞定位预测该基因主要在细胞核表达,亚细胞定位实验结果表明OsMND1确实主要在细胞核表达。2)对OsMND1超量表达的BLL-2x进行加倍,通过形态学、细胞学和分子生物学(PCR鉴定、荧光定量分析以及southern杂交)鉴定得到OsMND1超量表达的BLL-4x阳性植株(BC+),对BC+结实率和花粉育性统计,其统计结果相对于对照BLL-4x都有所提高;对败育种子统计发现BLL-4x主要败育原因是未受精,BC+主要在胚胎发育的灌浆期败育;对BC+和BLL-4x减数分裂时期染色体制片和花药半薄切片观察发现BC+能够改善非PMeS品系BLL-4x的减数分裂染色体异常行为和花药的不正常发育。3)对RNAi转基因材料DHN通过普通PCR、荧光定量和southern杂交检测后确定阳性植株,并将DHN和HN-4x进行结实率,花粉育性的比较发现,DHN在结实率和花粉育性方面相对于HN-4x都有所降低;DHN主要败育表现未受精,HN-4X主要败育在灌浆期;对DHN和HN-4x花药半薄切片观察显示与HN-4x相比,在DHN中OyMND1被干扰后导致减数分裂形成的小孢子大小不一致,四分体小孢子与绒毡层贴合不紧密以及单核时期小孢子干瘪皱缩,成熟后染色不深且花粉粒畸形等;减数分裂染色体观察发现与HN-4x相比较,DHN减数分裂行为受到负面影响,主要表现在偶线期染色体成单线状态,粗线期染色体缠绕混乱,终变期染色体不能正常分散导致中后期染色体分离不均等和落后现象。这些实验结果证实了OsMND1 确实参与了多倍体水稻的减数分裂过程,且可能在早期染色体重组的过程中起作用。4)为了进一步了解OsMND1基因在多倍体水稻减数分裂重组过程中的具体作用机制,对酵母和拟南芥中已经报道的与MND1有相互作用的基因在水稻中的同源基因HOP2、DMC1、RAD51、ZEP1在OsMND1超量表达的非PMeS中和在OsMND1干扰的PMeS中通过荧光定量分析发现,HOP2、DMC1和ZEP1在超表达的非PMeS中表达量上调,而在干扰的PMeS中表达量下调,但是RAD51在超表达植株中变化不明显,在干扰植株中表达量上调,说明OsMND1与减数分裂过程有着密切的关系。ZEP1是联会复合体的中心元件,它在超表达植株中的上调和在干扰植株中的下调说明OsMND1可能还跟减数分裂联会配对有关。