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目的：通过对四种饲养层细胞的分离培养，筛选一种简单有效的饲养层制备方法，以及筛选最佳的KM mES细胞培养体系。探讨KM mES细胞的最佳培养液以及消化液浓度，并获得一定代数的mES细胞集落。方法：
本试验分为两个部分：饲养层制备以及KM mES细胞的分离培养。饲养层包括：MEF饲养层、mUESCs饲养层、mBMFCs饲养层以及mBMSCs饲养层。
1.对四种饲养层细胞采用两种消化方式，一种是胰酶消化后，离心接种。第二种是胰酶消化后，当细胞收缩变圆，将要浮起时，吸出消化液，用培养液洗涤后，制成细胞悬液，接种。
2.采用三种方法制备KM mES细胞饲养层。第一种是不使用MMC处理；第二种是使用MMC处理后，消化离心，重新接种；第三种是经过MMC处理后培养2～3h，直接投入使用。采用第一种方法制备mBMFCs饲养层以及mBMSCs饲养层；采用后两种方法制备MEF饲养层和mUESCs饲养层。
3.采用饲养层和LIF联合使用，来分离培养小鼠ES细胞。将获得3.5d的胚胎直接培养在饲养层培养体系中，使ICM自然孵化，来分离培养KM mES细胞。
4.比较了三种消化液浓度(0.02％胰酶-0.008％EDTA；0.20％胰酶+0.04％EDTA；0.25％胰酶+0.05％EDTA)对ES细胞分离培养的影响。
5.在KM mES细胞培养中，探讨H-DMEM、HS、LIF、2-ME、Insulin对KM mES细胞体外培养的影响。
结论：1采用本试验改进细胞培养方法，分离得到了纯化的四种细胞，并采用本试验中改进的饲养层制备方法，成功制备出四种细胞的饲养层，用于分离培养ES细胞，其中mBMFCs饲养层效果最好，mBMSCs饲养层次之，MEF饲养层再之，mUESCs效果最差。2采用饲养层与LIF联合使用，从增殖5d的ICM分离出KM mESC，传至第5代，AKP染色阳性。30.02％胰酶-0.008％EDTA是KM mESC最佳消化液浓度4在本实验室条件条件下，得到KM mESC最佳的培养基(H-DMEM+15％FBS+1％NEAA+5％HS+106IU LIF+0.1mmol 2-ME+0.1mmol ITS+20μg/ml Insulin+103IU/ml penicilin and phytomycin)。