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背景:和西方相比,我国直肠癌比结肠癌发病率高,约60～75%的直肠癌为低位直肠癌,绝大多数癌肿可在直肠指诊时触及。另外,小于30岁的青年人直肠癌占比高,可达10%～15%。由于相当一部分患者就诊时已是进展期,手术创伤较大,排尿功能和性功能受损明显,永久性造口率和局部复发率高。直肠癌新辅助放化疗(n CRT)能起到缩小肿瘤体积,增加手术安全边界,减小手术创伤,增加保肛率,减少局部复发的作用。但是相当一部分直肠癌对放化疗不敏感,甚至在术前放化疗过程中即出现肿瘤进展。但现在还没有可用于临床预测直肠癌放疗敏感性的可靠指标。因此,寻找新的直肠癌放疗敏感性生物标记物对实现直肠癌患者的个体化治疗具有重要意义。本研究主要通过对临床资料的分析明确术后病理肿瘤退缩分级(TRG)对患者后续治疗和预后的影响以及通过蛋白质组学的方法寻找与放疗敏感性相关的生物标志物组合,进而实现在n CRT前对直肠癌放疗敏感性进行预测。方法:采用回顾性队列研究的方法。病例入组标准:(1)n CRT前病理证实为直肠腺癌,无远处转移;(2)n CRT前经MRI检查确诊为中低位直肠癌,肿瘤临床分期为c T3～4或N+和为保肛而进行n CRT的c T2N0期;(3)n CRT完成后行全直肠系膜切除术(TME)。排除标准:(1)术前短程放疗;(2)复发直肠癌或其它肿瘤病史;(3)放疗结束距离手术时间大于20周。根据上述标准,收集2010年1月至2018年6月期间,我院行n CRT和TME手术的入组患者377例,其中15例于术前出现远处转移,剩余362例中3例随访时间少于2个月,予以排除,最后359例进行预后分析。所有患者均采用长程调强放疗(IMRT),每周5次,每次2 Gy,共5周50 Gy;并同时口服卡培他滨;其中158例在放化疗结束后行CAPEOX或FOLFOX方案巩固化疗。所有患者均在n CRT后4～20周接受手术。术后随访了解肿瘤复发、转移和生存情况,包括无病生存期(DFS)、无远处转移生存期(DMFS)、无局部复发生存期(LRFS)和总体生存期(OS),放疗敏感性多因素分析用Logistic回归模型,生存分析用Kaplan-Meier法并行Log-rank检验,预后因素分析采用Cox比例风险模型。收集70例经病理会诊确诊的n CRT前直肠腺癌组织样本,采用DDA数据采集模式,结合稳定同位素标记策略(TMT10)寻找与直肠癌放疗敏感性密切相关的生物标志物。通过控制数据质量、蛋白质假阳性率等指标,在蛋白质组数据中共检测到5341种可信蛋白质。应用HCA和PCA聚类方法等对放疗敏感组(TRG 0+1)和放疗抵抗组(TRG2+3)蛋白质差异进行分析,并应用David网站对差异表达的蛋白质进行生物学功能注释和通路富集,利用R软件中的pathview软件包对富集到的部分通路进行展示。结果:377例患者术后病理TRG评分为0、1、2、3分的比例分别为20.4%、17.2%、33.4%、28.9%。肿瘤周径>1/2周(P=0.014)、放化疗前CEA升高(P=0.006)、低分化(P<0.001)、c T增加(P=0.030)与肿瘤退缩不良(TRG2+3)相关,巩固化疗(P=0.004)与肿瘤退缩良好(TRG0+1)相关,巩固化疗(OR=1.854,95%CI:1.052～3.266,P=0.033)、放化疗前CEA升高(OR=0.482,95%CI:0.275～0.847,P=0.011)是TRG的独立影响因素。TRG 0+1组患者的5年DFS(78.8%vs.64.0%,P=0.005)显著高于TRG 2+3组,两组OS无显著差异(88.0%vs.73.9%,P=0.098)。低分化(HR=1.873,95%CI:1.111～3.160,P=0.019)、yp T4(HR=5.945,95%CI:1.121～31.529,P=0.036)、yp N2(HR=2.158,95%CI:1.119～4.162,P=0.022)是DFS的独立危险因素,低分化(HR=1.985,95%CI:1.014～3.866,P=0.045)、yp N2(HR=3.835,95%CI:1.665～8.833,P=0.002)、APR(HR=2.016,95%CI:1.045～3.888,P=0.036)是OS的独立危险因素,而TRG并不是患者DFS和OS的独立影响因素。中低位局部进展期直肠癌n CRT后病理诊断yp T0–2N0的共121例(术后化疗组90例、术后未化疗组31例)。两组患者5年DFS和OS无明显差异(OS:79.1%vs82.9%,P=0.442;DFS:87.5%vs78.2%,P=0.667)。COX多因素分析表明,c T4(HR=4.563,95%CI:1.630～12.771,P=0.004)是DFS的独立影响因素、巩固化疗HR=0.253,95%CI:0.064～0.993,P=0.049)是DFS的独立保护因素,c T4(HR=5.294,95%CI:1.328～21.105,P=0.018)、吻合口漏(HR=10.169,95%CI:1.674～61.788,P=0.012)是OS的独立危险因素。76例TRG 0分(yp T0N0～2)的患者淋巴结阳性率为11.8%,全组5年DFS和OS分别为86.2%和94.7%。n CRT前血清CEA升高(HR=8.395,95%CI:1.378～51.151,P=0.021)和yp N+(HR=6.112,95%CI:2.289～91.209,P=0.005)是DFS的独立危险因素,未发现OS的独立影响因素。在蛋白质组学研究中,TRG 0+1和TRG2+3两组患者的基线资料无显著差异。对总体蛋白质进行无监督的PCA和HCA聚类无法区分抵抗组和敏感组,然后筛选出在敏感组和抵抗组差异表达的蛋白质(P<0.05且Fold change>1.2)19个后,聚类分析依旧无法区分放疗敏感或抵抗的直肠癌。一致性聚类分析将70例样本分成四种亚型,利用各亚型的差异蛋白进行无监督聚类分析可以将各亚型中放疗敏感与抵抗的样本区分开。在差异蛋白中筛选出Fold change>1.2的蛋白质,亚型1有46种蛋白质在敏感组中上调,56种蛋白质下调;亚型2有83种蛋白质在敏感组中上调,88种蛋白质下调;亚型3有13种蛋白质在敏感组中上调,11种蛋白质下调;亚型4有48种蛋白质在敏感组中上调,43种蛋白质下调。各亚型差异蛋白富集通路不一致。差异蛋白见附录。结论:1.巩固化疗、放化疗前CEA升高是直肠癌n CRT后TRG的独立影响因素,术前巩固化疗可提高肿瘤退缩率,放化疗前CEA升高的患者肿瘤退缩率降低。2.TRG 0+1组较TRG 2+3组DFS显著改善,yp N2、yp T4、低分化是DFS的独立危险因素,yp N2、低分化、APR是OS的独立危险因素,TRG不是DFS、OS的独立影响因素。3.n CRT后降期(yp T0～2N0)的局部进展期直肠癌患者未能从术后辅助化疗中显著获益,c T4是DFS的独立危险因素,巩固化疗是DFS的独立保护因素,c T4和吻合口漏是OS的独立危险因素。4.n CRT后肠壁原发灶完全缓解的患者预后良好,yp N+率约为11.8%,放化疗前CEA升高和yp N+是DFS的独立危险因素。5.基于n CRT前活检组织的蛋白质组学数据将直肠癌分出不同的组学亚型,每个亚型都可以将放疗敏感与抵抗的患者区分开,且不同亚型的差异蛋白富集的通路不一致,说明直肠癌有高度的异质性。由此揭示了活检样本的蛋白质组学信息以及基于组学信息的亚型分类对于预测直肠癌患者的放疗敏感性的重要意义。