细菌的抗生素耐药问题已成为全球范围内密切关注的重要问题,为了减轻和控制细菌耐药性的产生和传播,必须从基因水平上解析细菌产生耐药性以及耐药性传播的分子机制,从根源上找出解决耐药性问题的有效方法。整合子、整合性接合元件以及沙门氏一类基因岛是与耐药性传播相关的重要的可移动遗传元件,整合子可利用自身的整合酶捕获并整合外源的耐药基因,随转座子、接合性质粒等可移动遗传元件进行转移,是细菌耐药性产生的重要因素;整合性接合元件(ICE)和沙门氏一类基因岛(SGI1)是定位于细菌染色体上的较大的遗传元件,具有接合转移的能力,可作为耐药基因的载体,携带耐药基因在细菌间进行转移,直接导致耐药性的扩散。动物源性耐药细菌可通过食物传播或者经自然界物质循环释放到环境中给人类健康造成危害。奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)作为畜禽肉类中常检出的肠杆菌科细菌,是一种条件致病菌,可引起人类泌尿系统发生感染并诱发其它多种疾病,因此,对P.mirabilis中与耐药性传播相关的可移动遗传元件进行研究很有必要。该研究从来源于鸡肉样品的耐药的P.mirabilis入手,对P.mirabili 中整合子、整合性接合元件以及沙门氏一类基因岛的结构进行解析,鉴定和发掘一些新的可移动遗传元件的结构,研究耐药性产生和传播的机制。同时,通过比较E coli K-12 MG1655在9种不同类型抗生素压力下的转录组差异,分析大肠杆菌对不同的抗生素压力所采取的生理代谢响应策略及各生理途径之间的关系,初步确定细菌响应抗生素压力的分子机制。论文的主要研究内容及研究结果如下:1.从山东省某肉鸡屠宰厂的鸡肉样品中分离鉴定出57株具有多重耐药表型的P.mirabilis菌株。首先,采用6种不同的抗生素对来源于肉鸡屠宰场鸡肉样品的菌株进行初步筛选,分离鉴定出66株耐药的P.mirabilis,再通过脉冲场凝胶电泳多态性图谱对其进化关系进行研究,最终筛选出57株非重复的P mirabilis。药物敏感性实验证明这些P.mirabilis均为多重耐药菌株,每株菌至少对5种抗生素表现出耐药性,并且,对9种不同抗生素的耐药率均达到70.0%以上;在选取的1 1种抗生素中,只有对头孢他啶和头孢吡肟的耐药率相对较低。2.Ⅰ、Ⅱ型整合子在P.mirabilis中的分布较广,整合子可变区包含氨基糖苷类和磺胺类抗生素的耐药基因。对P.mirabilis中整合子及其可变区基因盒阵列进行综合分析,96.5%的P.mirabilis菌株含Ⅰ型整合子;59.7%的P.mirabilis含Ⅱ型整合子,并且97%的Ⅱ型整合子均与Ⅰ型整合子共存于同一菌株。在Ⅰ型整合子可变区检测到6种类型的耐药基因盒阵列:dfrA17-aadA5,aadA2,dfrA 12-orfF-aadA2,dfrA16-aadA2,arr3-dfrA27和dfrA l-orfC;而在Ⅱ整合子可变区只检出两种类型的基因盒:dfrA1-sat2-aadA1和linF2-dfrA1-orf441、Ⅰ、Ⅱ型整合子可变区的耐药基因一般介导氨基糖苷类抗生素和磺胺类抗生素的耐药性。3.耐药的基因的转移与Ⅰ型整合子的转移有显著的相关性。P.mirabilis中包含介导β-内酰胺类、喹诺酮类、氯霉素类和四环素类抗生素耐药性的基因。其中qnrS、qnrD、blaTEM、tetC、tetA、cmlA和cat的检出率分别为98.2%、87.7%、73.7%、49.1%、45.6%、31.6%和22.8%。耐药基因在P.mirabilis的分布与其多重耐药的表型相一致,一株P.mirabilis中常包含多种不同的耐药基因。接合转移实验证明Ⅰ、Ⅱ型整合子能从P.mirabilis转移到E.coli J53中,并使该受体菌获得对相应抗生素的耐药性。通过进一步的研究发现,介导β-内酰胺类、喹诺酮类和氯霉素类药物抗性的耐药基因与Ⅰ型整合子发生了共转移,这些耐药基因的转移与Ⅰ型整合子的转移存在显著的相关性。4.在P.mirabilis中发现3个新的SXT/R391家族ICEs(ICEPmiChn2、ICEPmiChn3和ICEPmiChn4)并对其全序列进行分析。在P.mirabilis中共检测出4个SXT/R391家族ICEs,通过PCR和全基因组测序获得其全序列,其中ICEPmiChn2、ICEPPmiChn3和ICEPmiChn4是3个新的ICEs结构,大小分布在55～104 Kb。对ICEs的序列进行分析发现,其可变区能够整合不同来源的DNA序列,并且存在多种耐药基因。细菌的药物敏感实验结果表明,这些耐药基因可介导其宿主菌产生对红霉素、氨基糖苷类、氯霉素类、磺胺类或β-内酰胺类抗生素的耐药性。5.包含完整核心基因的ICEs具有接合转移的功能,在地理位置上相近的ICEs在进化上具有明显的关联性。接合转移实验表明包含完整核心基因的ICEPmiChn2、ICEPPmiChn4和ICEPmiJpn1可以从P.mirabilis转移至受体菌E.coli J53中,并使该受体菌对相应抗生素产生耐药性。因此,ICEs可作为耐药基因的载体,携带耐药基因在细菌之间进行转移,促进耐药性的扩散和传播,而ICEPmiChn3由于核心基因的缺失丧失了接合转移的能力。对SXT/R391家族ICEs之间进化关系的分析结果表明,在地理位置上相关的ICEs通常在进化上具有明显的关联性,在我国发现的ICEs很可能是从相同的祖先进化而来的。6.在P.mirabuilis中鉴定出3个新的SGI1变体(SGI1-PmJN16、SGI1-PmJN40和SGI1-PmJN48),其结构与以往发现的SGI1有很大的区别。从P.mirabilis中检测出5个SGI1的变体并通过PCR及基因组测序获得其全序列SGI1-PmCAU和SGI1-PmABB与先前报道的SGI1的结构相同,其余3个SGI1s(SGI1-PmJN16、SGI1-PmJN40和SGI1-PmJN48)具有新的结构,是新型SGI1变体。SGI1-PmJN16包含一个新的多重耐药区域,其多重耐药区的整合子可变区基因盒阵列为dfrA 12-orffaadA2-qacEΔ 1-sull-chrA-orfl,chrA基因通过编码铬酸盐转运蛋白可使其宿主对铬酸盐的耐受度明显提高。7.SGI1-PmJN40是目前为止发现的唯一能够形成两种环状结构的SGI1,SGI1-PmJN48是片段最长的SGI1结构,它们能在IncA/C质粒的协助下在细菌之间进行转移。SGI11-PmJN40包含两个相同DR-R序列,这一特殊的结构表明,它可能形成两种不同大小的环状结构。较大的SGI1(SGI1-PmJN40-L)含有副溶血性弧菌、希瓦氏菌和发光杆菌的染色体DNA片段,其中包含多个具有潜在调节功能的基因。通过PCR可以直接检测到较小的SGI1环状形态(SGI11-PmJN40-S)的存在,较大的SGI11(SGI1-PmJN40-L)能在P.mirabilis与E.coli之间发生接合转移,因此可以判定SGIl-PwJN40能以两种不同的形式存在于P.mirabilis JN40菌株中。SGI1-PmJN48是目前发现的片段最长的SGI1结构,它包含一个很大的含有P.mirabilis染色体DNA和pPm14C18质粒DNA的基因簇,同时也包含多个耐药基因盒阵列(blaPSE-1-qacE-sul1,mphA-mrx-mphR,arr3-cat3-blaOxA-1-aac,blaCTX-M,dfrA17-aadA5-qacEΔ l-sul1-chrA),可介导对红霉素、氨苄西林、利福平、氯霉素、甲氧苄啶、卡那霉素/链霉素、磺胺类抗生素和铬酸盐的抗性。接合转移实验证明了在IncA/C质粒的协助下,SGI1s能以接合的方式转移至E.coli J53中,并赋予其相应的抗生素耐药性,SGI1s在耐药性的传播中有重要作用。8.卡那霉素对大肠杆菌整体转录水平的影响最大,而多粘菌素E的影响最小。在应对抗生素压力时,大肠杆菌不同生理途径之间采取的响应策略存在明显的协同性。将E.coli K-12 MG1655在头孢他啶、卡那霉素、亚胺培南、环丙沙星、多粘菌素E、四环素、丝裂霉素C、氯霉素和红霉素等9种抗生素的亚抑菌浓度下培养并进行转录组测序。对转录组测序数据的分析结果表明,不同抗生素所引起的大肠杆菌转录组的表达模式差异极大,卡那霉素对大肠杆菌整体转录水平的影响最大,有76.5%的基因在转录水平上发生了显著的变化;而多粘菌素E是影响最小的抗生素,仅造成4.7%的基因发生转录水平上的显著变化;其它7种抗生素也分别对大肠杆菌的基因表达产生了较大的影响(28%～52%)。大肠杆菌在应对不同抗生素压力时所调整的代谢途径有共性也存在差异,抗生素的处理导致大肠杆菌营养摄入、能量储存和脱毒途径的普遍下调以及蛋白质合成途径的普遍上调(除多粘菌素E外);卡那霉素的压力导致不同生理途径的普遍下调(运动和蛋白质合成途径除外);而红霉素和氯霉素的压力则导致不同生理途径的普遍上调(营养摄入和脱毒除外)。对大肠杆菌代谢途径的聚类分析表明同一类型的途径之间具有相类似的响应模式,在多数抗生素压力下发生上调或下调的趋势比较统一。9.大肠杆菌采取被动和逃避的策略应对卡那霉素的压力,而采取主动的策略应对红霉素和氯霉素的压力;大肠杆菌可能通过少数几个关键的调控元件实现对生理代谢途径的调控来应对抗生素压力。大肠杆菌在生理途径上对抗生素响应模式的分析表明,大肠杆菌对不同抗生素压力的响应采取了明显不同的应对策略,大肠杆菌在应对卡那霉素的压力时显著提高了自身的运动能力并降低能量代谢和各种物质合成,属于一种被动和逃避的应对策略;而在应对红霉素和氯霉素的压力时,大肠杆菌则全面提高自身能量代谢和物质合成,属于一种主动的应对策略,大肠杆菌应对抗生素压力时,能根据抗生素的不同采取有针对性的策略提高自身对环境的适应性。通过对大肠杆菌差异表达基因上游调控元件的分析发现,大多数中心碳代谢和能量代谢途径受Crp的调控;考虑到不同抗生素所引发的响应策略是有限的(如大肠杆菌对红霉素和氯霉素的响应策略类似),大肠杆菌很可能通过少数几个关键调控元件直接或间接地实现对生理代谢途径的调控。这种应对策略可以使得大肠杆菌在多条生理途径上的改变形成合力,互相配合,提高自身对抗生素的耐受力。综上所述,该研究对动物源性P.mirabilis中的整合子、整合性接合元件以及沙门氏一类基因岛进行了系统的研究,鉴定出新的可移动遗传元件并对其结构进行解析,阐明了可移动遗传元件在细菌的进化、适应性、以及耐药性的产生和传播中的重要作用,使人们对细菌耐药性的获得及传播机制有了更深入的理解。另外,该研究针对大肠杆菌在9种不同类型抗生素压力下的转录组差异,应用组学分析对大肠杆菌在不同抗生素压力下所采取的响应策略以及大肠杆菌各生理途径之间的关系进行研究,初步探索了细菌响应抗生素压力的分子机制,为新型高效抗生素的开发提供思路。