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目的:本课题采用正交试验法优化酶解法提取鹿茸多肽的工艺条件,以鹿茸中多糖和多肽提取物为原料,依据响应面设计的原理优化鹿茸糖肽颗粒的制备工艺,以提高鹿茸多糖和多肽提取物的提取效率和有效部位制剂的利用率。采用紫外-可见分光光度法对鹿茸糖肽颗粒中鹿茸多糖和鹿茸多肽进行含量测定,应用柱前衍生化法对鹿茸糖肽颗粒中鹿茸多糖的单糖组成及单糖含量进行测定,利用三（羟甲基）甲基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Tricine-SDS-PAGE）技术和高效凝胶过滤色谱法（HPGFC）对鹿茸糖肽颗粒中鹿茸多肽的分子量分布情况进行测定,从而为鹿茸糖肽颗粒的质量标准研究提供实验依据。材料与方法:1.以鹿茸为原料,利用本课题组前期优化出的提取鹿茸多糖的最佳工艺参数进行鹿茸多糖的制备,再采用酶解法对提取多糖后剩余的药渣中的鹿茸多肽进行提取,采用正交试验法对酶解体系的反应时间、加酶量、p H三个因素进行优化,利用高效凝胶过滤色谱法,以鹿茸多肽中分子量低于30 k Da的色谱峰面积占比为评价指标,筛选出酶解法提取鹿茸多肽的最佳工艺条件,再经超滤膜对提取的鹿茸多肽进行纯化,得到小分子鹿茸多肽,经过冷冻干燥处理后得到冻干粉,作为后期研究的原料。2.以鹿茸多糖提取物和鹿茸多肽提取物为原料,采用响应面法,以颗粒成型率、流动性、溶化率和吸湿率的综合评分值为评价标准,优化混合辅料比例、辅料用量及乙醇浓度三个制备工艺参数,为鹿茸糖肽颗粒的制备工艺及其质量控制研究奠定基础。3.将鹿茸糖肽颗粒中的鹿茸多糖进行分离纯化后,经1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）试剂进行柱前衍生化后进行HPLC分析,测定鹿茸糖肽颗粒中鹿茸多糖的单糖组成及单糖的含量;再采用苯酚-硫酸法测定鹿茸糖肽颗粒中鹿茸多糖的含量。4.将鹿茸糖肽颗粒中的鹿茸多肽进行分离纯化后,应用对分离胶浓度进行优化后的三（羟甲基）甲基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（Tricine-SDSPAGE）和对流动相和检测波长进行优化后的高效凝胶过滤色谱法（HPGFC）两种方法对鹿茸糖肽颗粒中的鹿茸多肽的分子量分布情况进行测定;再采用福林酚法测定鹿茸糖肽颗粒中鹿茸多肽的含量。结果:1.通过正交试验法,以鹿茸多肽中分子量低于30 k Da的色谱峰面积占比为评价指标,对酶解法提取鹿茸多肽的酶解体系的反应时间、加酶量、p H三个因素进行考察,得出最合适的酶解法提取鹿茸多肽的工艺条件为反应时间为2 h,加酶量为3.5%,p H为8。2.采用响应面法,以颗粒成型率、流动性、溶化率和吸湿率的综合评分值为评价标准,优化混合辅料比例、辅料用量及乙醇浓度三个因素,得出鹿茸糖肽颗粒制备的最佳工艺参数:辅料比例为0.36,辅料用量为3,乙醇浓度为50%,即混合辅料的组成为糊精:微晶纤维素=0.36,混合辅料用量为主药用量的3倍,润湿剂乙醇的体积分数为50%,所制得的颗粒临界相对湿度为76.8%。3.对经PMP试剂进行柱前衍生化后的鹿茸糖肽颗粒中的鹿茸多糖进行HPLC分析,得出组成鹿茸多糖的单糖按照含量由高到低顺序分别是葡萄糖＞盐酸氨基葡萄糖＞核糖＞甘露糖＞半乳糖,其中葡萄糖为鹿茸糖肽颗粒中多糖的主要组成单糖;甘露糖、核糖、盐酸氨基葡萄糖、半乳糖四者含量较为接近。苯酚-硫酸法以葡萄糖标准品为对照,测得鹿茸糖肽颗粒中鹿茸多糖的含量为31.02 mg/g。4.Tricine-SDS-PAGE法最佳分离胶浓度为12%,以对照品Marker为对照品,测得鹿茸糖肽颗粒中鹿茸多肽的分子量主要分布在25 k Da左右、48 k Da左右、63~75 k Da及100 k Da左右;优化检测条件后的HPGFC法以牛血清白蛋白、卵清蛋白、胰岛素和杆菌肽为对照品,测得鹿茸糖肽颗粒中鹿茸多肽的分子量主要集中在22~29 k Da,峰面积约占总峰面积的77.0%,还有部分分布在9 k Da左右,峰面积约占总峰面积的18.7%。两种方法所得结果基本接近。福林酚法以牛血清白蛋白标准品为对照,测得鹿茸糖肽颗粒中鹿茸多肽的含量为146.6 mg/g。结论:1.酶解法提取鹿茸多肽的最佳工艺为:在体系pH为8的条件下,加入3.5%的碱性蛋白酶,酶解2 h。此条件可有效降低鹿茸多肽的分子量并提高鹿茸多肽的提取率。2.鹿茸糖肽颗粒制备的最佳工艺参数为:混合辅料的组成为糊精:微晶纤维素=0.36,混合辅料用量为主药用量的3倍,润湿剂乙醇的体积分数为50%,制得的颗粒符合相关规定,此条件可作为鹿茸糖肽颗粒的制备工艺。3.鹿茸糖肽颗粒中鹿茸多糖的单糖组成按含量高低顺序分别为葡萄糖＞盐酸氨基葡萄糖＞核糖＞甘露糖＞半乳糖,方法学考察结果符合含量测定的相关要求。苯酚-硫酸法测得鹿茸糖肽颗粒中鹿茸多糖的含量为31.02 mg/g,且方法学考察结果符合含量测定要求。可作为鹿茸糖肽颗粒中鹿茸多糖的含量测定及质量控制方法。4.Tricine-SDS-PAGE法测得鹿茸糖肽颗粒中鹿茸多肽的分子量主要分布在25 kDa左右、48 k Da左右、63~75 k Da及100 k Da左右;优化检测条件后的HPGFC法测得鹿茸糖肽颗粒中鹿茸多肽的分子量主要集中在22~29 k Da,峰面积约占总峰面积的77.0%,还有部分分布在9 k Da左右,峰面积约占总峰面积的18.7%。两种方法所得结果基本接近。福林酚法测得鹿茸糖肽颗粒中鹿茸多肽的含量为146.6 mg/g,且方法学考察结果符合含量测定的相关要求,可作为鹿茸糖肽颗粒中鹿茸多肽的含量测定及质量控制方法。