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第一部分NF-κB/IκB信号通路在TCS抗肝癌HepG2细胞中的作用研究背景：天花粉蛋白(trichosanthin, TCS)是从植物栝楼天花粉块根中分离提取的有效成分,属于Ⅰ型核糖体失活蛋白,具有引产,免疫调节,抗肿瘤及抗病毒等多种生物学功效。近年来TCS的抗肿瘤活性备受关注,多种凋亡机制参与TCS诱导肿瘤细胞凋亡。与宫颈癌、绒毛膜上皮癌等对TCS高度敏感的肿瘤细胞株相比,肝癌HepG2细胞对TCS低度敏感,其机理尚未阐明。核转录因子kappa B (nuclear factor kappa B, NF-κB)广泛存在于真核生物中,参与细胞生长、分化、炎症及免疫反应、凋亡等多种基因表达调控。目前,NF-κB活化是否参与了TCS抗肿瘤过程,以及在该过程中的作用机制,尚未见报道。研究目的：本实验选取对TCS低度敏感的肝癌HepG2细胞作为细胞模型,研究TCS对HepG2细胞NF-κB活性的影响,以及NF-κB活化在TCS诱导HepG2细胞凋亡中的作用,揭示HepG2细胞对TCS低度敏感的机制,为TCS抗肿瘤实验研究,提供理论依据。研究方法：MTT法检测HepG2和MIHA细胞经不同浓度TCS处理48 h后的细胞存活率。提取经TCS处理细胞的胞浆和胞核蛋白,应用Western blot法检测胞浆中IκB-a蛋白、NF-κB p65亚单位、Cox-2蛋白水平,以及胞核中NF-κB p65亚单位水平。采用双荧光素酶报告基因检测系统检测NF-κB转录活性。应用Hoechst33258染色,检测TCS诱导的细胞凋亡,并统计细胞凋亡率。通过生物抑制剂(IκB-DM)和化学抑制剂(PDTC)抑制NF-κB活化,观察IKB-a蛋白、NF-κB p65亚单位的改变,以及细胞存活率和凋亡率改变。研究结果：(1)经200μg/ml TCS处理48 h后,HepG2和MIHA细胞生长抑制率分别约为48%和17%,表明TCS对HepG2具有选择性的抑制作用。(2)TCS能迅速诱导肝癌HepG2 IKB-a蛋白水平显著降低,并伴有胞浆中NF-κB蛋白水平降低及胞核NF-κB蛋白水平增高,即NF-κB核易位。TCS可以明显促进NF-κB转录活性,具有时间依赖性。并且TCS能诱导NF-κB下游Cox-2基因表达增加。(3)通过稳定转染,建立了稳定表达IκB-DM和空白对照(pEGFP-N1) HepG2细胞系。空白质粒对照组细胞胞浆中IκB-a和NF-κB p65蛋白变化趋势与未转染质粒的HepG2细胞相似；IκB-DM组IKB-a蛋白基础水平显著增加,而且TCS处理持续达3h也未见降解。同时IκB-DM组未见NF-κB p65蛋白胞浆胞核蛋白水平变化。经MTT检测,50μg/ml TCS处理48 h后,IκB-DM组的细胞存活率(43%)比空白质粒组(63%)低20%(P＜0.05)。应用PDTC对HepG2细胞进行预处理抑制NF-κB活化,Hoechst 33258染色观察发现,(PDTC+TCS)组的细胞凋亡率较TCS组增加了16%。结论：(1)TCS对肝癌HepG2细胞具有选择性细胞毒性作用,使得TCS具有较好的抗肿瘤应用前景。(2)TCS能引起HepG2细胞胞浆中IKB-a蛋白水平降低,导致NF-κB被释放、发生核转移,并调节下游基因表达。(3)NF-κB活化可抑制TCS诱导的HepG2细胞凋亡,导致HepG2对TCS的低度敏感；而有效抑制NF-κB信号通路能增强HepG2细胞对TCS的敏感性,促进TCS抗肿瘤作用。第二部分地塞米松促进天花粉蛋白诱导的人肝癌HepG2细胞凋亡研究背景：地塞米松(dexamethasone)属于糖皮质类激素(glucocorticoids),具有抗炎及免疫调节等药理作用。地塞米松能通过抑制NF-κB活化诱导多种淋巴瘤细胞凋亡。近年来,学者们发现地塞米松能有效预防化疗药物引起的恶心、呕吐,促进了5-氟尿嘧啶、顺铂等化疗药物的抗肿瘤效果。然而地塞米松对TCS诱导人肝癌细胞凋亡的调节作用尚未见报道。研究目的：本实验研究地塞米松是否能促进TCS诱导的HepG2细胞凋亡,并进一步确认NF-κB活化在TCS诱导HepG2细胞凋亡中的作用,为TCS单独或药物联合抗肿瘤的临床实验研究,提供依据。研究方法：HepG2细胞经地塞米松(1μM,24 h)预处理后,与不同浓度TCS联用处理48 h后,MTT法检测细胞存活率；应用Western blot法检测胞浆中IκB-a蛋白水平；采用Hoechst 33258染色检测细胞凋亡,并统计细胞凋亡率。研究结果：(1)TCS单独处理时,IC50超过200μg/ml, TCS与地塞米松联用后,IC50约为50μg/ml,表明地塞米松促进了TCS诱导的HepG2细胞凋亡。(2)经地塞米松预处理后,IKB-a蛋白明显增加,且联用TCS后,IKB-a蛋白水平未见明显改变。结论：(1)TCS与地塞米松联用使HepG2细胞对TCS的敏感性增加,促进了TCS诱导的HepG2细胞凋亡发生。(2)地塞米松能显著提高IKB-a蛋白的基础水平,提示地塞米松通过促进IκB-a转录水平,使IKB-a蛋白表达增加,从而抑制了胞浆中NFκB的解离,最终抑制NFκB的活化,促进了TCS的抗肿瘤作用。