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本论文在8种主要海水养殖鱼类对刺激隐核虫感染的敏感性试验中,发现黄斑蓝子鱼对刺激隐核虫感染的敏感性较低,表现出较强的抵抗力,平均感染强度仅为0.92±0.969,显著低于其它鱼类(p<0.05)。进一步研究发现,黄斑蓝子鱼的血清在体外对刺激隐核虫的幼虫及滋养体均具有较强的杀灭作用,其中对幼虫的阻动效价高达44.51±22.982。利用光学显微镜,扫描电子显微镜及荧光显微镜对体外阻动过程观察的结果表明该血清能够导致刺激隐核虫幼虫纤毛的脱落、大核的肿胀破裂,继而导致外膜的破裂,内容物的释放。另外,光学显微镜下观察也发现黄斑蓝子鱼的血清同样能导致刺激隐核虫滋养体细胞的破裂及内容物的释放。
在此研究的基础上,我们还首次测定了黄斑蓝子鱼的血清对其它两种寄生虫(淡水小瓜虫及布氏锥虫)及各种细菌的体外作用效果。结果表明在体外该血清对两种寄生虫均具有较强的杀灭作用。其中对于淡水小瓜虫的阻动效价为21.33±9.238,且作用机制与对刺激隐核虫的相似,均导致细胞核膜和外膜的破裂。黄斑蓝子鱼血清对于布氏锥虫的最小杀虫浓度为1.5%,并且在该浓度下1h内就能使虫体全部崩解。激光共聚焦显微镜观察发现该血清能导致虫体形态发生明显改变,细胞破裂,内容物释放。血清的抑菌谱测定试验中也发现黄斑蓝子鱼的血清对所测定的3种革兰氏阳性菌和6种革兰氏阴性菌均有抑菌效果,但对于黑曲霉和小麦赤霉菌两种真菌则无抑菌作用。扫描电镜观察结果表明该血清能导致大肠杆菌的菌体表面出现明显的孔洞,但对于金黄色葡萄球菌则只造成菌体表面产生褶皱及有分泌物的产生而并没有观察到明显的孔洞出现。
利用包括盐析、阳离子交换层析和反相高效液相色谱等一系列的蛋白质纯化方法,最终从黄斑蓝子鱼的血清中分离到了一种活性蛋白(抗寄生虫蛋白,APP),体外检测该蛋白对刺激隐核虫具有杀灭效果。另外,采用超滤、反相高效液相色谱和Native-PAGE的纯化方法,同样也分离到了一种有抗菌效果的蛋白。综合蛋白分子量测定、Western杂交及蛋白功能相互验证的结果表明这两种纯化方法所得的蛋白为同一种蛋白组分。生理状态下,该蛋白以带两个正电荷的阳离子形式存在,并且是以相同单体构成的多聚体的形式发挥功能,质谱分析其单体的精确分子量为61739.871 Da。N端15个氨基酸的序列为:SSVEKNLAACLRDND。蛋白经胰蛋白酶消化后进行肽指纹谱分析发现其与日本鲭中报道的L-氨基酸氧化酶具有高度的相似性,结合N端测序的结果,可基本确定该活性蛋白为一种L-氨基酸氧化酶。
纯化蛋白APP在刺激隐核虫上作用位点的亚细胞定位观察结果进一步证实了该蛋白对刺激隐核虫的作用效果,并阐明了该蛋白是通过与虫体的细胞膜和细胞核相互作用而使虫体细胞破裂的机制来杀死虫体的。APP对于刺激隐核虫的最小杀虫浓度为0.088mg/ml。利用纯化蛋白APP测定其对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最小杀菌浓度分别为5.493μg/ml和0.352mg/ml。利用纯化的蛋白APP所制备的多克隆抗体对该蛋白在鱼体的组织分布进行研究,结果表明该蛋白在脾脏、肾脏、鳃和血液中表达量较多,而在脑、肝脏、肌肉、心脏、小肠中则未检测到有表达。
根据已报道的几种鱼类L-氨基酸氧化酶的基因进行相似性比对,在保守区域设计了两对简并引物,并通过PCR扩增到了一个1103bp的基因序列。分析发现其所编码蛋白中的某些肽段与质谱所测定的APP部分多肽片段具有较高的匹配度,初步证明该基因即为编码所分离到的纯化蛋白APP的基因。相似性比对结果表明其与已报道的几种鱼类的L-氨基酸氧化酶具有较高的相似性。以上结果表明,该蛋白作为一种非特异性的多功能因子,在鱼类的先天性免疫、抵抗各种微生物的感染中发挥了重要的作用并可在药物开发中作为一种潜在的备选因子。