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研究背景:雄激素在体内具有重要的生理功能,能促进男性的第二性征的发育和成熟以及男性生殖器官的维持和精子的发生。人体内主要的雄激素睾酮(T)和它的代谢产物 5α-双氢睾酮(DHT),被普遍认为是通过和雄激素受体(AR)结合发挥它们的生物效应。前列腺癌的激素治疗正是以此为依据。除了这种基因组作用模式,有越来越多的证据显示:同孕激素和雌激素一样,雄激素也能够产生快速的、非基因组效应如诱导细胞内游离钙离子(Ca2+)的增加。钙离子是普遍存在的细胞内的第二信使,胞内的游离钙离子浓度([Ca2+]i)的变化影响细胞的许多进程,包括增生,凋亡,细胞活力和基因表达。因此研究雄激素对前列腺癌细胞[Ca2+]i 变化的影响及机制对于改善前列腺癌的疗效具有重要临床价值。 目的:体外研究雄激素对前列腺癌细胞[Ca2+]i 的影响,并探讨其机制。 方法:复苏、培养前列腺癌 LNCaP 细胞株。细胞传代后,将细胞悬液(106/ml)接种于改装的 35mm Petri 细胞培养皿中,置 5%CO2、37℃细胞培养箱培养 48～72 小时,待细胞充分粘附于中央玻璃皿底后用于检测。检测时, 首先将细胞培养皿内的 RPMI1640 弃去,用 Krebs-HEPES 溶液冲洗三遍后,加入 Krebs-HEPES溶液 1ml,pluronic F-127 和 Fura-2/AM,使其终浓度分别为 0.04%和 5μM-10μM,放 CO2孵箱中,37℃,30 分钟,中间晃动几次,取出后,再用 Krebs-HEPES 冲洗三次,以去除细胞表面和细胞外液中的 Fura-2/AM。加入 1ml 的 Krebs-HEPES 溶液,室温放置备用。实验时,将细胞培养皿置于荧光倒置相差显微镜载物台上。固定好后,找到一个细胞分散较均匀的视野,根据实验要求加入不同的试剂进行单细胞内[Ca2+]i 水平的监测。 结果:1、DHT 浓度低于 10-9M 时[Ca2+]i 无变化,10-8M、10-7M 时[Ca2+]i 在 20-25秒内分别从基础值 29±5 nM 上升为峰值 65±9nM 和从基础值 28±4 nM 上升为峰值 193±33nM,两者峰值有显著差异(P<0.01)。然后较长一段时间维持在峰值水平。10-6M 时峰值为 210±44 nM,与 10-7nM 时无显著差异(P>0.05)。2、细胞外无 Ca2+时,[Ca2+]i 基础值为 9±2 nM, 10-6M DHT 刺激后[Ca2+]i 峰值为 10±2 nM,两者无显著差异(P>0.05)。3、用 L-型 Ca2+电压门控通道阻断剂 5×10-5 M Verapamil、10-4M Diltiazem、5×10-3M Nifedipine 预先孵育 5 分钟后,10-6M DHT 刺激后[Ca2+]i 分别从基础值 45±7 nM、50±7 nM、54±6 nM 升为峰 - 2 -<WP=6>硕士毕业论文 中文摘要值 51±11 nM、51±8 nM、57±8 nM,基础值和峰值相比无显著差异(P>0.05)。4、用磷脂酶 C 抑制剂新霉素 1mM 预先孵育 5 分钟后,[Ca2+]i 基础值为 42±7nM ,10-6M DHT 刺激后[Ca2+]i 峰值为 181±35 nM ,两者有显著差异(P<0.001)。5、用蛋白合成抑制剂放线菌酮 10uM 预先孵育 3 小时后,用 10-6M DHT 刺激细胞后,[Ca2+]i从基础值46±15 nM上升为峰值 153±29 nM,两者有显著差异(P<0.001)。6、用雄激素受体(AR)拮抗剂醋酸环丙孕酮(CPA)1000 mM 预先孵育 20 分钟,10-6M DHT 刺激后[Ca2+]i 从基础值 38±6 nM 升为峰值为 186±29 nM ,两者有显著差异(P<0.001)。7、用 10 nM 睾酮刺激细胞后,[Ca2+]i 从基础值 30±7 nM上升为峰值 109±11 nM,两者有显著差异(P<0.05)。8、用 10 nM 睾酮-牛血清白蛋白复合物(T-BSA,短期内不能穿过细胞膜)刺激细胞后,[Ca2+]i 从基础值 33±6 nM 上升为峰值 64±11 nM,两者有显著差异(P<0.05),作用强度比T 减弱。9、用 G 蛋白抑制剂百日咳毒素 100ng/ml 预先孵育 24 小时后,用 10-6M DHT刺激细胞前后 [Ca2+]i 分别为基础值 37±6 nM 和峰值 63±14 nM,两者有显著差异(P<0.05)。10、用 G 蛋白抑制剂 GDPβs 500uM 预先孵育 20 分钟后,用 10-6MDHT 刺激细胞前后 [Ca2+]i 分别为基础值 36±8 nM 和峰值 37±8 nM,两者无显著差异(P>0.05)。11、用酪氨酸激酶抑制剂金雀异黄素(Genistein)50uM预先孵育 20 分钟后,用 10-6M DHT 刺激细胞后 [Ca2+]i 从基础值 41±7 nM 上升为峰值 200±57 nM,两者有显著差异(P<0.001)。 结论:1、DHT 能迅速诱导[Ca2+]i 的升高,并且通过非基因组机制。2、细胞内的 Ca2+增加来源于细胞外 Ca2+通过 L-型电压门控通道流入细胞内,细胞内钙库未释放 Ca2+。3、此效应不是通过细胞内 AR 介导,而是通过细胞膜上雄激素结合位点介导,不能被 AR 拮抗剂 CPA 阻断。4、细胞膜上雄激素结合位点可能属于 G蛋白耦联受体或同 G 蛋白耦联受体的功能密切相关,酪氨酸激酶未参与此效应。