一、研究背景动脉粥样硬化是血管疾病的主要病因,也是世界范围内主要的致死、致残病因,动脉粥样硬化是一个复杂的病理生理过程,涉及到多个进程,包括内皮损伤、脂质浸润、氧化应激、炎症反应和细胞增殖与迁移。不断进展的动脉粥样硬化促使血管管腔进行性狭窄,引起局部缺血,外科介入治疗能恢复组织器官一定的血流灌注。介入治疗依赖于经皮腔内血管成形术(PTA),利用球囊扩张或支架植入开通和增宽受影响的血管管腔。虽然这些治疗手段能成功地血管重建,但随着时间的推移,一些开通的血管会再次狭窄,从而降低了PTA的疗效。外科介入治疗的主要目标是通过PTA开通和维持血管管腔开放,对于成功重建功能性内皮覆盖也很重要。但是外科介入治疗可能因机械性扩张引起硬化斑块影响的血管壁进一步损伤、引起刺激、炎症反应和随后的组织重塑与修复,此过程的过度反应将限制介入治疗的成功率。在球囊血管成形术的病例中,内向的血管重塑和过度的血管平滑肌细胞增殖侵入血管管腔内膜,形成异常增生的新生内膜,促使管腔狭窄。在支架植入区域,血管平滑肌细胞增殖仍是主要的治疗限制因素。血管平滑肌细胞(VSMCs)通过收缩机制参与控制血管的紧张度和直径,成熟的血管平滑肌细胞是不活跃的,表现为收缩表型,并稳定表达平滑肌收缩蛋白,包括α-平滑肌肌动蛋白(SM?-actin)、平滑肌22?(SM22?)、肌球蛋白重链(MHC)、平滑肌细胞分化特异性抗原及H1轻链等,这些都被认为是血管平滑肌细胞的分化、收缩型分子标志。在稳定的状态,血管平滑肌细胞极少增殖,且表现低合成能力。血管平滑肌细胞不是终分化细胞,仍然保持卓越的表型可塑性,这是血管平滑肌细胞区分终分化的骨骼肌细胞和心肌细胞的特征。细胞外信号调控着血管平滑肌细胞的表型转换,并伴随着血管平滑肌细胞增殖、迁移、合成型分子蛋白表达增多,分化、收缩型分子蛋白表达减少。通常血管平滑肌细胞表型转化发生在胚胎血管生产、新生血管形成、血管重塑和血管损伤的修复过程中。在应对血管损伤或局部环境改变时,分化的血管平滑肌细胞能去分化,细胞增殖、迁移和细胞外基质合成增多,分化、收缩型分子表达减少。大量数据提示:血管平滑肌细胞有卓越的可塑性,在疾病进展的过程中,可转化为许多功能不同的表型,如:合成型血管平滑肌细胞、巨噬细胞样细胞、间充质干细胞(MSC)软骨样或成骨样细胞等。血管平滑肌细胞表型转化是环境因素诱导,而不是自发的,当受到细胞外细胞因子、剪切力、基质成分等因素的刺激后,血管平滑肌细胞去分化,参与新生内膜的形成。众多因子控制着血管平滑肌细胞的迁移和增殖能力,包括血小板源性生长因子-BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)。血小板源性生长因子作为血清源性生长因子被发现,能促进成纤维细胞、血管平滑肌细胞和神经胶质细胞的生长,是一种强效促有丝分裂剂,在血管平滑肌细胞表型转化、增殖及迁移过程中发挥着重要作用,也是血管生成的重要调控因子。PDGFs主要由内皮细胞、活化的巨噬细胞和平滑肌细胞产生,活化后由血小板储存和释放。PDGF家族包括四种同种异质多肽链(A,B,C和D链),他们能组成5种不同的二聚体形式(PDGF-AA,PDGF-AB,PDGF-BB,PDGF-CC和PDGF-DD),PDGF-BB同源二聚体是血管平滑肌细胞增殖最有效的刺激物。据报道PDGF-BB通过活化各种细胞内信号转导通路启动多种生物效应,这些信号通路在VSMCs的增殖和迁移中扮演着重要的角色。因此抑制PDGF-BB介导的VSMCs增殖和迁移可能成为抑制动脉粥样硬化及其术后再狭窄的一种有效方法。补体C1q肿瘤坏死因子相关蛋白(CTRPs)是一高度保守的脂联素家族旁系同源类似物。CTRP6是CTRPs家族成员之一,由四个单独的域构成,包括一N端信号肽域、一短段可变域、一胶原样结构域和一C端C1q样球状结构域。脂联素受体1被认为在肌内脂肪细胞中CTRP6的一种受体。据报道有不断增长的证据表明CTRP6涉及多种生理学过程,比如细胞增殖、脂质代谢、胰岛素敏感度、能量平衡和心肌保护。最近的研究表明过表达CTRP6显著抑制血管紧张素II(Ang II)介导的血管内皮细胞功能损伤和细胞凋亡。但是CTRP6对VMSC增殖和迁移的影响尚未清楚。本研究的目的就是调查它在VSMC中的角色和可能的机制。二、研究目的1、检测CTRP6在动脉粥样硬化斑块病变组织和正常动脉组织中的表达情况,分析CTRP6的表达是否与动脉粥样硬化相关。2、用PDGF-BB诱导人动脉平滑肌细胞(HASMC)增殖、迁移,检测CTRP6在PDGF-BB刺激人动脉平滑肌细胞后的表达水平的变化,分析CTRP6的表达是否与血管平滑肌细胞的增殖、迁移相关。3、通过CTRP6重组质粒过表达CTRP6或外源性CTRP6刺激的方法观察其对PDGF-BB诱导的人动脉平滑肌细胞增殖、迁移的影响,并探讨可能机制。三、研究方法(一)第一部分用qRT-PCR和Western Blot技术检测动脉粥样硬化内膜组织和正常动脉组织CTRP6的基因和蛋白表达水平差异,初步判断CTRP6是否与动脉粥样硬化相关。以PDGF-BB诱导人动脉平滑肌细胞,促进其增殖和迁移的能力增强,再次用qRT-PCR和Western Blot技术检测PDGF-BB刺激人动脉平滑肌细胞后CTRP6表达水平的变化。应用基因重组技术构建的CTRP6真核表达载体pcDNA3.1-CTRP6,利用脂质体转染人动脉平滑肌细胞中。利用Western Blot技术检测转染pcDNA3.1-CTRP6是否能在人动脉平滑肌细胞中成功表达。(二)第二部分应用MTT实验检测过表达CTRP6对PDGF-BB刺激的人动脉平滑肌细胞增殖能力的影响。用Transwell趋化运动、侵袭实验以及细胞划痕实验检测过表达CTRP6对PDGF-BB刺激的人动脉平滑肌细胞迁移能力的影响;用Western Blot技术检测过表达CTRP6对PDGF-BB刺激的人动脉平滑肌细胞MMP-2和MMP-9表达的影响。用不同浓度外源性CTRP6(5ug/ml组、10ug/ml、20ug/ml)刺激PDGF-BB诱导的人动脉平滑肌细胞,再次用Transwell趋化运动和MTT实验检测其对人动脉平滑肌细胞迁移和增殖能力的影响。(三)第三部分通过CTRP6重组质粒在PDGF-BB刺激的人动脉平滑肌细胞中过表达CTRP6,用Western Blot技术检测其对收缩型分子标志?-SMA和SM22?的表达变化,以及对PI3K/Akt/mTOR信号通路分子表达、活化的影响。用不同浓度的外源性CTRP6刺激PDGF-BB诱导的人动脉平滑肌细胞,检测其对收缩型分子标志?-SMA和SM22?表达的影响。四、研究结果(一)第一部分人动脉粥样硬化组织中CTRP6的mRNA表达水平较正常动脉组织中的表达水平显著降低;同样,与正常动脉组织相比,动脉粥样硬化组织中CTRP6蛋白的表达水平也显著降低。HASMC中CTRP6的mRNA和蛋白表达水平在PDGF-BB刺激后发生明显改变,PDGF-BB刺激HASMC后,其CTRP6 mRNA及蛋白的表达较均明显降低。pcDNA3.1-CTRP6重组质粒转染人动脉平滑肌细胞48h后,CTRP6蛋白表达水平较pcDNA3.1空质粒对照组明显增高。我们在PDGF-BB诱导的HASMC中转染pcDNA3.1-CTRP6,发现pcDNA3.1-CTRP6也能在其成功表达,并能逆转PDGF-BB诱导HASMC的CTRP6蛋白表达减低。(二)第二部分1.CTRP6抑制PDGF-BB诱导培养的HASMC增殖及转移能力。为了检测CTRP6对HASMCS增殖的影响,用pcDNA3.1-CTRP6转染PDGF-BB诱导培养的HASMCS。MTT实验结果表明:PDGF-BB诱导HASMCs的增殖率较未诱导组显著增强,但这种促增殖作用能被过表达CTRP6有效的抑制,在没有PDGF-BB诱导的HASMCs中过表达CTRP6对HASMCs的增殖没有影响。用Transwell趋化运动试验、侵袭实验及细胞划痕实验评估CTRP6对PDGF-BB诱导HASMCs迁移能力的影响。Transwell趋化运动试验和侵袭实验表明:PDGF-BB诱导HASMCs的迁移细胞数目较无PDGF-BB诱导组显著增加,而这种促迁移作用能被过表达CTRP6有效的逆转;在没有PDGF-BB诱导HASMCs中过表达CTRP6对HASMCs的迁移没有影响。细胞划痕实验得出类似的结果,PDGF-BB诱导HASMCs的划痕间距的差值较未诱导组显著增大,过表达CTRP6有效地抑制了这种促迁移作用;同样,在没有PDGF-BB诱导HASMCs中过表达CTRP6对HASMCs的迁移没有影响。我们检测外源性CTRP6对HASMCs的影响发现:不同浓度的外源性CTRP6(5ug/ml组、10ug/ml、20ug/ml)也显著抑制PDGF-BB诱导培养的HASMC增殖及迁移能力,且呈浓度依赖型。2.PDGF-BB刺激HASMCs后MMP-2和MMP-9表达显著增强;HASMCs过表达CTRP6能有效地抑制PDGF-BB诱导HASMCs的MMP-2和MMP-9表达;在没有PDGF-BB刺激HASMCs中过表达CTRP6,其MMP-2和MMP-9表达不受影响。(三)第三部分1.CTRP6能促进PDGF-BB诱导VSMCs收缩型分子标志的表达。动脉粥样硬化的发生、发展及术后再狭窄中,VSMCs的表型转化是细胞增殖和迁移的重要步骤,因此我们检测PDGF-BB诱导HASMCs中CTRP6对VSMCs分子标志表达的影响。PDGF-BB诱导培养的HASMCs能显著降低血管平滑肌细胞收缩型蛋白分子(?-SMA和SM22?)的表达;在PDGF-BB诱导HASMCs中过表达CTRP6能阻止?-SMA和SM22?的表达下降;在无PDGF-BB诱导的HASMCs中过表达CTRP6,对其?-SMA和SM22?的表达没有影响。我们用不同浓度的外源性CTRP6检测其对PDGF-BB诱导HASMCs的收缩型蛋白分子表达的影响,发现不同浓度外源性CTRP6(5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml)刺激后,PDGF-BB诱导HASMCs的收缩型蛋白分子(?-SMA和SM22?)的表达也显著增加,且与外源性CTRP6呈浓度依赖型。2.为了进一步探索CTRP6抑制PDGF-BB诱导HASMCs增殖和迁移的机制,我们研究CTRP6在PDGF-BB诱导HASMCs中对PI3K/Akt/mTOR信号通路分子的表达、活化影响。Western结果表明:与对照组相比,PDGF-BB诱导HASMCs中PI3K/Akt/mTOR的磷酸化水平显著提高。但在PDGF-BB诱导HASMCs中过表达CTRP6能显著抑制PI3K/Akt/mTOR的磷酸化。另外我们在HASMCs中转染pcDNA3.1-CTRP6重组质粒48小时,再加入PDGF-BB(10ng/ml)刺激0小时、6小时及12小时分别检测PI3K/Akt/mTOR磷酸化表达情况,发现过表达CTRP6以时间依赖型抑制PI3K/Akt/mTOR的磷酸化。五、结论1.CTRP6在人动脉粥样硬化斑块组织中表达减低。2.CTRP6抑制PDGF-BB诱导VSMCs的增殖和迁移,并抑制MMP-2、MMP-9表达,促进?-SMA和SM22?的表达。3.CTRP6至少部分通过抑制PI3K/Akt/mTORs信号通路而抑制PDGF-BB诱导VSMCs的增殖和迁移;CTRP6可能成为治疗动脉粥样硬化及支架植入术后再狭窄等血管增殖性疾病潜在的治疗靶点,为临床应用提供新的思路。