论文部分内容阅读
本文首先通过PCR扩增的方法得到小金海棠MxIRT1去信号肽和可变区区域的亚克隆,并将其构建到不同营养缺陷筛选型的酵母表达载体,转化不同二价金属离子转运体的酵母突变株,通过营养缺陷筛选阳性转化子。运用酵母的异源互补法结合电感耦合等离子体质谱仪对不同载体转化的酵母细胞进行了体内各种离子含量的测定结果证实了MxIRT1能够转运二价金属阳离子,但转运效率不同。MxIRT1对于Cd有较强的转运能力;对Zn、Fe的吸收有一定作用;可以转运Ni、Co、Cu;而与Mn的转运作用不明显。同时可以证明,过量可被细胞吸收的重金属离子都对其有一定的毒害,只是细胞的吸收量和可承受量因金属离子不同而有所不同。Cd的毒害最严重,微量即可抑制细胞生长。通过对去信号肽和可变区的MxIRT1的研究表明,1)MxIRT1前端约105bp的信号肽序列,它的缺失推测会影响到蛋白的功能。2)存在于跨膜结构域Ⅲ、Ⅳ之间的富含组氨酸的可变区对于Zn、Fe的转运有一定作用。它的缺失导致酵母对Zn的吸收量有明显下降。对Fe的影响在吸收量和细胞生长状态上也比较明显。而Cd、Co、Ni的转运只受到较弱的影响。根据结构预测MxIRT1是一种膜蛋白,为进一步确认它的亚细胞定位,利用构建好的诱导型酵母表达载体pYES2.0-MxIRT1∷GFP,通过GFP与活细胞荧光膜染料FM4-64结合的方法在荧光显微镜和共聚焦激光显微镜下观察。初步推断:MxIRT1定位在质膜上;并且其在质膜上的分布不是均匀的,而呈现‘脂筏’结构;以半乳糖为碳源诱导表达发现其最适观察时间在6-20hr之间。利用构建好的正、反义植物表达载体侵染烟草,已得到T0代的种子。