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前言先天性肥厚性幽门狭窄(congenital hypertrophic pyloric stenosis, CHPS)是新生儿常见的消化道先天性畸形,其发病率具有种族、性别和地区差异,男性较多,占90%以上。多合并有其他先天性疾病。主要临床症状为出生后15～25天,于进食后10～30 min出现频繁呕吐胃内容物,无胆汁;体检于中上腹部可扪及橄榄样包块。主要原因在于幽门部肌肉肥厚所致的幽门管腔狭窄及胃出口的梗阻。目前病因及发病机理不清,研究表明其发病与遗传及环境因素有关。先后有学者认为染色体16p12-p13位点、一氧化氮合酶(NOS1)基因、胃动素基因与其发病相关,但未获更多证据支持。最近国外学者通过全基因组扫描分析,认为瞬时受体电位离子通道蛋白6(transient receptor potential channel 6, TRPC6)可能为CHPS的易感基因。以上研究基本是针对国外人群进行的,尚无我国的相关深入研究。故本研究先通过对307例住院CHPS患者进行临床数据的回顾性分析,研究其临床发病特点;然后选择19个核心家系(患者和父母双亲),进行全基因组芯片扫描,初步探索其发病相关基因位点;再扩大样本,采用测序的方法进行基因分型,针对初步确定的候选基因位点(TMX基因的多态性位点rs7161242及rs7160810)进行无关个体的病例-对照分析及核心家系的传递不平衡检验(Transmission/Disequilibrium Test,TDT),进一步验证其与CHPS的关系,并利用生物信息学方法,研究多态性位点的不同基因型对基因的结构及功能的影响;最后采用免疫组化方法,研究多态性位点所在的TMX基因在CHPS患者幽门平滑肌组织中的表达。第一部分中国汉族人群先天性肥厚性幽门狭窄临床特征目的:探讨中国汉族人群先天性肥厚性幽门狭窄(CHPS)的临床发病特点,为诊断、治疗,以及遗传易感基因研究和流行病学调查提供依据。方法:对307例CHPS住院患儿的病历资料进行回顾性总结和分析,观察项目包括患儿性别、发病年龄、体重变化、入院时电解质及动脉血气情况、B超检查结果及合并其他先天性疾病情况。将发病10天内治疗者列为早期组,而超过10天者列为晚期组,比较这两组动脉血气、电解质及日平均体重增加的差别。结果:307例患儿中男性262例,女性45例,发病年龄1~351天,去掉离散程度较大者6例,其余301例平均发病年龄23.8±13.0天。患儿出生体重1.6~4.5kg,平均3.24±0.44kg;只有1对同卵双胞胎同时患病;合并其它先天性疾病共62例(20.2%),前二位的是心血管和消化系统的先天性异常。幽门环肌B超厚度3~8mm,平均5.4±1.1mm。早期组日平均体重增加明显大于晚期组,而低钾血症、低氯血症及高碳酸血症发生率明显低于晚期组(P<0.05);血钠与血pH值无显著性差异。结论:中国汉族人群CHPS以男性为主,发病年龄为3~5周,幽门环肌厚度5.4±1.1mm,合并其它先天性疾病比例较高,但家庭聚集发病少见。对于在出生后3~5周内出现持续性呕吐患儿,应高度警惕CHPS,并应尽快诊治,以减少低氯低钾性碱中毒的发生,避免病情进一步恶化。第二部分CHPS核心家系的全基因组芯片扫描分析目的:从全基因组范围内探索CHPS发病相关基因。方法:对由19个患儿及父母组成的核心家系,采用Affymetrix公司的SNP 6.0基因芯片进行全基因组芯片扫描,并用golden helix 6.4软件包的FBAT模块进行分析,搜索与CHPS发病相关的基因及位点,对所发现的有显著性意义的位点,进一步根据基因的功能及P值,选择候选基因。结果:以p值达10-5为判定标准,总共发现105个SNP位点,通过初步筛选,发现位于硫氧还蛋白相关跨膜蛋白1基因(thioredoxin-related transmembrane protein 1,TMX)上的多态性位点rs7161242与中国汉族人群CHPS发病相关联。结论:TMX基因的rs7161242位点与中国汉族人群CHPS发病相关联。第三部分TMX基因与先天性肥厚性幽门狭窄遗传易感性的关联研究目的:探索TMX多态性位点rs7161242[c.492T>G]及rs7160810[c.648G>A]与CHPS发病的相关性。方法:应用PCR及测序的方法,对多态性位点rs7161242及rs7160810进行基因分型,对22个核心家系进行TDT分析,进一步对31例CHPS患儿与60名正常对照采用病例-对照研究,来探索这两个SNP位点与CHPS发病的相关性,并利用在线软件对这两个SNP位点进行生物信息分析,研究其多态性与TMX基因结构与功能之间的关系,进一步利用免疫组化方法来研究TMX基因表达与CHPS发病的关系。结果:测序结果验证了芯片扫描的准确性,未发现新的突变位点;患儿、父母及正常对照者组内这两个多态性位点的Hardy-Weinberg平衡检验均P>0.05,TDT检验提示多态性位点rs7161242的G等位基因及rs7160810的A等位基因的均与CHPS发病相关,其P值分别为2.0×10-4和5.699×10-5;连锁不平衡分析结果提示:这两个位点的r2为0.757,D’值为0.893,成紧密连锁。病例-对照研究提示rs7160810位点A等位基因纯合子患病风险明显增加(OR=3.932,95%CI:1.545~10.006, x 2 =8.924,P=0.012);rs7161242位点G等位基因纯合子患病风险明显增加(OR=4.222,95%CI:1.655~10.772, x 2=9.630,P=0.002)。在线分析发现多态位点rs7161242位于第6外显子剪接受点(acceptor site)区域内,会导致熵值和自由能的改变。rs7161242位点的TT基因型的最大熵低于GG基因型(-19.55 VS -22.22),所转录的RNA的二级结构的自由能也低于GG基因型;rs7160810位点GG基因型的最大熵也低于AA基因型,所转录的RNA的二级结构的自由能也低于AA基因型,提示rs7161242位点的GG基因型及rs7160810位点的AA基因型相对不稳定,且其转录的mRNA也相对不稳定。免疫组化结果提示TMX基因在幽门平滑肌细胞膜和细胞浆表达,未发现在细胞核中表达。采用Image-Pro Plus 6.0(IPP)图像分析系统测量阳性细胞平均光密度值(IOD mean,MOD),半定量分析发现TMX基因在CHPS患儿幽门部平滑肌的表达量明显弱于正常对照者(0.117±0.033 VS 0.229±0.044,P<0.001)。结论:1、TMX基因的多态性位点rs7161242[c.492T>G]及rs7160810[c.648G>A]与中国汉族人群CHPS发病密切相关。rs7161242位点GG基因型及rs7160810位点AA基因型是CHPS患病的危险因素。2、TMX基因的两个多态性位点rs7161242[c.492T>G]及rs7160810[c.648G>A]会影响RNA的二级结构。3、TMX基因在平滑肌细胞膜及细胞浆中表达,未发现在细胞核中表达。4、TMX基因在CHPS患儿的幽门环形肌中表达显著低于正常对照。