载单宁酸铁及二氢卟吩纳米粒用于光声成像及治疗视网膜母细胞瘤的实验研究

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第一部分载单宁酸铁及二氢卟吩纳米粒的制备及性能检测目的构建以单宁酸铁(FeⅢ-tannic acid,FeⅢTA)为外壳,PLGA为载体并包裹二氢卟吩e6(Chlorin e6,Ce6)的新型多功能纳米粒(FeⅢTA/PLGA/Ce6,TPCNPs),检测其理化性质、光热及化学动力学性能。细胞实验检测Y79细胞对纳米粒摄取的能力、活性氧产生情况。方法双乳化法制备PLGA/Ce6纳米粒,再将FeⅢTA通过一步法包裹于PLGA/Ce6纳米粒外壳,获得FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒。检测其形貌特征(透射电子显微镜及扫描电子显微镜)、粒径电位、紫外吸收光谱、Fe与Ce6的包封率、载药率、纳米粒的磁滞曲线等材料表征。检测纳米粒在808 nm激光仪激发下体外的光热性能,利用热显像仪检测其温度改变,通过亚甲基蓝(Methylene blue,MB)体外检测羟基自由基(·OH)的产生。通过流式细胞术及激光共聚焦显微镜观察Y79细胞对纳米粒的摄取情况,评估纳米粒在Y79细胞内产生的活性氧的能力。结果成功制备出FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒,透视电镜下显示形态均一呈圆形,纳米粒外侧呈现FeⅢTA清晰的壳核结构,扫描电镜显示该纳米粒具有良好的分散性。粒径为(297.02±9.59)nm,PDI:0.123,电位为(-28.32±3.35)m V。紫外吸收光谱显示TPCNPs保留了Ce6的吸收峰,根据Ce6的紫外分光光度计(UV)绘制的标准曲线,测定出Ce6包封率为(74.99±2.57)%,载药量为(4.16±0.15)%。电感耦合等离子质谱(ICP-OES)测得FeⅢTA包封率为(4.92±0.35)%,载药量为(0.02188±0.001566)%,体外光热实验证明FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒具有良好的光热效应并呈浓度依赖,经5次加热/冷却的循环下,可见该纳米粒的光热效应具有良好的热稳定性。通过MB检测出该纳米粒的Fenton反应能够生成·OH。该纳米粒能有效被Y79细胞摄取,荧光强度呈时间依赖。流式细胞术结果表明,化学动力学治疗组和化学动力学协同光热治疗组能产生大量ROS。结论成功制备FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒,并检测其理化性质。证实该纳米粒具有良好的光热性能及产生·OH的能力,纳米粒有效地被Y79细胞摄取后能够产生ROS进行化学动力学治疗。第二部分载单宁酸铁及二氢卟吩纳米粒用于治疗视网膜母细胞瘤的实验研究目的体外、体内评估FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒的光声成像(Photoacoustic imaging,PA)效果,利用活体荧光成像技术(In vivo imaging procedure)观察纳米粒在体内的分布情况。体外评估FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒的生物相容性,并检测化学动力学联合光热疗法对视网膜母细胞瘤的杀伤效果。方法建立凝胶模型对不同浓度FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒进行体外光声成像检测并分析信号强度。在裸鼠皮下注射Y79细胞,建立皮下移植瘤模型并进行体内光声成像实验。经裸鼠尾静脉注射纳米粒后对不同时间点(0,2,4,6和12小时)采集光声图像。使用活体荧光成像系统研究纳米粒在小鼠体内的分布。将人视网膜上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞与FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒共孵育,通过CCK-8法评估其生物相容性。将Y79细胞分为四组:(1)空白对照组(2)单纯激光组(3)化学动力学治疗组(4)化学动力学协同光热治疗组,经不同分组处理后,通过流式细胞术,活/死实验,评估纳米粒子对Y79细胞的杀伤作用。结果体外成像结果显示,FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒光声信号于浓度呈正相关。荷瘤裸鼠经尾静脉注射纳米粒后,肿瘤部位的光声信号逐渐增强,并在12 h达到最高峰。活体荧光结果显示纳米粒注入尾静脉12 h后,裸鼠肿瘤区域的荧光强度达到最强,与光声成像结果相一致。FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒生物相容性良好,流式细胞术实验结果:与空白对照组的凋亡率(3.397±1.29%)相比,激光组(5.88±2.25%)Y79细胞凋亡率无显著差异(P>0.05),TPCNPs组(10.73±1.92%)凋亡率高于对照组(P<0.05);TPCNPs+激光组(41.58±5.24%)凋亡率明显高于对照组(P<0.0001),激光共聚焦观察Y79细胞活/死实验的结果与流式细胞术凋亡结果相一致。结论制备的FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒在体外模型中具备良好的光声成像性能,荷瘤裸鼠实验表明纳米粒可在肿瘤部位有效富集并显示优异的光声成像效能,活体荧光实验验证了纳米粒注射后治疗的最佳时间为12 h。FeⅢTA/PLGA/Ce6纳米粒具有良好的生物相容性,在经808 nm激光激发后产热进行光热治疗,光热协同化学动力学疗法杀伤Y79细胞效果最强。该纳米粒对视网膜母细胞瘤的前期诊断及光治疗领域具有广阔的应用前景。
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