绵羊肺腺瘤病毒ENV基因的克隆、序列分析与原位杂交检测

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绵羊肺腺瘤病(Sheep Pulmonary Adenomatosis SPA)是一种传染性肺癌,并可实验复制。SPA与人的支气管上皮细胞癌(Bronchioloalveolar carcinoma BAC)极为相似,是研究BAC的天然动物模型。D型反转录病毒(JSRV)是SPA的真正病原。 我们对四例被检绵羊进行病理学检查,初步诊断为SPA,进一步进行分子水平研究,根据国外报道的外源性绵羊肺腺瘤病毒env基因序列,设计外源性病毒特异引物,以绵羊总DNA内的exJSRV前病毒DNA为模板,PCR扩增,确诊被检绵羊为SPA。将PCR产物纯化,并与pueM-T载体相连,转化大肠杆菌,经PCR,酶切鉴定及序列测定,得知所得env片段与Ⅰ型JSRV同源性为88%,与Ⅱ型JSRV同源性为87%,证明所克隆基因为外源性目的基因,至此,我们在国内首次获得了env阳性克隆。 Env基因编码的囊膜蛋白包括亲水性的表面蛋白(SU)和疏水性的跨膜蛋白(TM),TM决定病毒粒子和细胞膜受体之间的相互作用,而SU是高变异基因元件,含有受体结合位点和主要的抗原决定簇。 用地高辛随机引物法标记exJSRV特异的env片段,制备探针,原位杂交检测SPA肺组织中的RNA及前病毒DNA,结果表明SPA患羊肺组织内有JSRVenv基因mRNA的表达,同时也检测到了前病毒DNA,而相应的阴性对照却无阳性信号,证实外源性病毒特异的DNA探针在致瘤性前病毒的整合位点和整合的外源性前病毒的检测中具有可信度。
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