牦牛（yak）起源于中国,经过长期自然选择与人工驯养,形成了能够适应高原的古老珍稀牛种,具有耐寒、抗缺氧、善攀爬、食性较杂、能利用其它牛种不能利用的高寒牧草资源,集众多优良家畜性能于一身,被誉为“高原之舟”或“全能家畜”。自2012年以来,西藏牦牛群常发以呼吸道症状为特征的传染性疾病,严重威胁着当地养牛业发展。牛支原体（Mycoplasma bovis,M.bovis）是引发牛呼吸道疾病综合征（Bovine respiratory disease complex,BRDC）的最主要病原体之一,可引起牛的肺炎、关节炎、乳腺炎、中耳炎、角膜结膜炎、流产甚至死亡,给养牛业带来严重威胁。为了解该病的流行现状与防控对策,本研究进行了西藏牦牛源牛支原体的分离鉴定,并对分离株进行了相关生物学特征研究,主要研究内容如下:1.西藏牦牛牛支原体的分离鉴定及其生物学特性研究本研究从牛支原体（M.bovis）血清抗体阳性的西藏牦牛群采集具有明显呼吸道症状的病牛鼻腔粘液,进行M.bovis的分离鉴定。通过菌落形态观察、M.bovis特异性uvr C基因PCR扩增及序列分析、生长曲线测定、药敏试验和生化特性试验,结果显示,所获10个分离株,低倍镜下在固体培养基上菌落呈典型的“煎蛋样”,电镜下呈“爆米花样”,瑞氏染色呈紫色多形性;PCR扩增得到与目的基因大小相符的条带;经同源性分析,分离株与M.bovis国内其它分离株、国际参考株PG45具有高度同源性;培养时,24 h内为迟缓期,随后进入对数期,42 h进入稳定期,84h进入衰亡期;对强力霉素、卡那霉素敏感,对林可霉素、环丙沙星存在一定的耐药性;均能利用胆固醇,但不发酵葡萄糖和乳糖,不水解明胶和精氨酸,不分解尿素和甘露醇。2.牛支原体西藏牦牛株对氟喹诺酮类抗生素的耐药机制研究本研究选用恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星3种氟喹诺酮类抗生素作为受试药物,采用微量稀释法对10株M.bovis西藏牦牛株进行药物敏感性试验、体外耐药菌株诱导试验、稳定性耐药和交叉耐药性试验,并以氟喹诺酮类抗生素的敏感株、耐药株和体外诱导高度耐药株为研究对象,对其进行氟喹诺酮类抗生素耐药决定区（Quinolone Resistance Determining Regions,QRDR）的靶位（gyr A、gyr B、par C、par E）基因突变分析与药物主动外排系统的初步确认。结果显示,M.bovis西藏牦牛株对环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星存在不同程度的耐药;经体外诱导筛选出对一种氟喹诺酮类抗生素稳定性耐药的9株M.bovis,均对其他两种氟喹诺酮类抗生素存在交叉耐药现象;敏感株在靶位基因par C中存在无意义的氨基酸（Asp 84）突变,耐药株在靶位基因gyr A或par C中存在单一位点的氨基酸（Ser 83 Phe/Tyr或Ser 80 Ile/Arg、Ser 81 Phe）突变,体外诱导的高度耐药株主要在靶位基因gyr A和par C中存在氨基酸（Ser 83 Phe和Ser 80 Ile）突变,而靶位基因gyr B和par E中未检测到相关位点的氨基酸发生突变;经药物主动外排系统分析显示,M.bovis西藏牦牛株不存在表达的以氟喹诺酮类抗生素为底物的主动外排系统。以上研究结果表明,M.bovis西藏牦牛株对上述3种氟喹诺酮类抗生素均存在不同程度的耐药,当M.bovis持续处于该药物压力下,则容易产生耐药菌株,且药物靶位基因gyr A或par C位点的氨基酸易发生突变,若两个及以上基因位点的氨基酸同时发生突变,则会产生高度耐药株。3.牛支原体西藏牦牛株的临床致病性研究本研究选取其中3株M.bovis西藏牦牛优势菌株（T 6、T 8和T 10）分别进行鸡胚感染试验与家兔临床致病性试验。结果表明,对照组胚体未见异常;试验组胚体均出现不同程度的发育迟缓,血管游离,甚至死亡。剖检结果显示,对照组胚体发育良好,无任何病理变化;试验组死亡胚体表面出现不同程度的充血、出血现象,个体较小。但感染家兔后,攻毒当天就出现微弱的体温升高,直到第6 d,体温达到峰值,超过正常体温约2～2.5℃,随后体温缓慢下降,至第11 d,体温基本恢复正常;随着体温的升高,伴随着精神沉郁,反应迟钝,饮水采食量下降、体重增速变缓,尤其到了后期,鼻腔出现白色黏液分泌,并伴有轻微的呼吸啰音现象,但体温一旦恢复,以上症状随之消失。病理剖检显示,对照组肺泡细胞排列整齐,间质排列均匀有序,无出血现象;试验组出现不同程度的肺泡壁增厚,肺泡腔出血,腔内可见脱落的肺泡上皮细胞和淋巴细胞,肺泡内或间质中可见嗜酸性微小颗粒状蛋白样物质和大量炎性细胞。同时采集肺脏进行M.bovis分离鉴定,不仅PCR鉴定为阳性,而且也分离到M.bovis,这说明上述症状与病理变化均由M.bovis所致,而且T 6的致病力最强。4.牛支原体西藏牦牛株感染家兔后micro RNA的差异性分析本研究通过M.bovis西藏牦牛株感染家兔后,了解家兔肺脏组织中miRNA表达的差异。结果发现,试验组与对照组拥有687个一样的miRNA,试验组拥有57个不同的miRNA,对照组拥有48个特异性的miRNA;相同miRNA在进行差异基因比较时发现,存在163个上调和188个下调,其中49个上调和69个下调差异显著（P<0.05）,34个上调和42个下调差异极显著（P<0.01）,还有80个上调和77个下调差异不显著（P>0.05）。在GO富集和KEGG富集分析中,发现最显著富集的是蛋白质结合（protein binding）通路、癌症通路（Pathways in cancer）和肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）。在miRNA保守性分析中,发现miRNA在bta（Bos taurus,牛）中有242个,仅次于hsa（Homo sapiens,人类）中出现频率最高的261个,说明miRNA具有高度保守性。本研究从miRNA层面为研究M.bovis感染的发病机理提供理论依据。5.牛支原体西藏牦牛株感染家兔后lnc RNA、circ RNA的差异性及ce RNA网络构建本研究通过M.bovis西藏牦牛株感染家兔后,了解家兔肺脏组织中m RNA、lnc RNA和circ RNA的表达差异,得到试验组与对照组家兔肺脏的m RNA、lnc RNA和circ RNA表达谱。发现共有683个m RNA表达差异,其中366个表达上调,317个表达下调;共有844个lnc RNA表达差异,其中416个表达上调,428个表达下调;共有317个circ RNA表达差异,其中231个表达上调,86个表达下调。最后,基于目标miRNA-m RNA、miRNA-lnc RNA、miRNA-circ RNA、ce RNA（lnc RNA、circ RNA）-miRNA-m RNA构建调控网络,为进一步开展lnc RNA和circ RNA功能及其作用机制奠定了前期工作基础和积累了经验。综上所述,西藏牦牛群常发多发的呼吸道传染性疾病主要病原体是M.bovis,可经呼吸道、消化道和生殖道转播,临床中应使用敏感抗生素进行治疗,但目前还没有效果确实有效的疫苗进行预防,仅能通过检疫来不断淘汰阳性牛,以减少外界环境中病原体的数量,从而达到预防控制的目的,该研究成果为西藏牦牛群呼吸道传染病的治疗和防控提供了参考依据。