本研究采用以表皮生长因子为主要诱导物质的诱导剂，而表皮生长因子主要通过MAPK途径对细胞分化进行调控。因此采用以表皮生长因子为主的诱导剂在体外诱导MSCs分化成表皮细胞，然后利用在诱导剂中分别加入p38途径和ERK途径的特异性抑制剂SB203580和PD98059，从而初步探讨p38途径和ERK途径对体外诱导MSCs分化成表皮细胞的影响。研究工作分为两部分： 第一部分：大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及诱导分化为表皮细胞观察。 研究目的：研究大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及体外诱导分化为表皮细胞的观察。 研究方法：将大鼠处死，无菌条件下用密度梯度离心法分离大鼠MSCs，在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养。倒置相差显微镜下观察MSCs的生长情况及形态特征，培养至第3代的间充质干细胞用免疫细胞化学检测表面标记CD34、CD44的表达，同时用流式细胞仪测定CD34、CD44的阳性率，从而对分离的MSCs进行鉴定。细胞随机分为对照组、诱导组，诱导7d时用免疫细胞化学染色法和流式细胞仪技术检测MSCs表面CK5/8和CK19的表达。免疫细胞化学染色采用两步法，具体操作按试剂盒说明书进行。同时设不加一抗的阴性对照。在光学显微镜下进行组织学观察，以胞浆呈棕黄色着色为阳性结果，而流式细胞仪通过细胞计数直接给出二者的阳性率。 研究结果：①采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离出的MSCs在倒置相差显微镜下呈克隆样生长，12d左右达到细胞融合，细胞形态呈比较均一的梭形，传代后细胞形态无变化。②免疫细胞化学检测第三代的MSCs显示CD44均呈阳性，CD34均呈阴性，流式细胞仪检测显示细胞表面抗原CD44阳性率96.62％，CD34阳性率2.58％。③体外特定条件下可诱导MSCs分化为表皮细胞，MSCs诱导3天时，免疫细胞化学显示MSCs中出现少量角蛋白5/8(CK5/8)、角蛋白19(CK19)阳性表达细胞，7天时阳性表达细胞明显增多，对照组二者均阴性表达，流式细胞仪检测显示CK5/8、CK19阳性率分别为3.01％、6.47％。 第二部分：大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为表皮细胞信号机制研究。 研究目的：通过在诱导剂中添加SB203580、PD98059，初步探讨MAPK信号途径对MSCs诱导分化为表皮细胞的调控机制。 研究方法：随机将细胞分为诱导组、p38阻断组、ERK阻断组，在诱导至第7天时将细胞取出进行免疫细胞化学染色和流式细胞仪检测CK5/8、CK19染色阳性率，探讨MAPK信号途径对MSCs诱导分化为表皮细胞的影响。所有数据均以-x±s表示，采用X2检验，SPSS软件对所有数据进行统计学处理。 研究结果：①镜下连续观察各组细胞生长情况良好，形态无明显变化。②诱导7d时，免疫细胞化学检测诱导组CK5/8、CK19阳性率分别为(5.84±3.92)％、(8.34±3.42)％；p38阻断组二者阳性率分别为(1.70±2.16)％、(6.48±4.14)％，低于诱导组(P＜0.05，P＜0.05)；ERK阻断组二者阳性率分别为(9.42±3.73)％、(12.98±5.13)％，高于诱导组(P＜0.05，P＜0.05)，也明显高于p38阻断组(P＜0.01，P＜0.01)。③MSCs诱导7天时流式细胞仪显示诱导组CK5/8、CK19阳性率分别为3.01％、6.47％；p38阻断组CK5/8、CK19阳性表达率分别为1.43％、5.41％，低于诱导组(P＜0.01，P＜0.01)；ERK阻断组CK5/8、CK19阳性表达率分别为5.54％、7.56％，高于诱导组(P＜0.01，P＜0.05)，也高于p38阻断组(P＜0.01，P＜0.01)。④油红O脂肪染色发现p38阻断组有少量阳性表达细胞，其它组均为阴性。 研究结论： 1.从大鼠骨髓中分离出的MSCs形态呈均一的梭形，纯度高，免疫细胞化学及流式细胞仪检测显示CD44阳性，CD34阴性。 2.EGF可诱导MSCs分化为表皮细胞，免疫细胞化学及流式细胞仪检测显示CK5/8、CK19阳性。 3.p38途径在促进MSCs分化为表皮细胞过程中起积极作用，而ERK途径则相反。 4.SB203580可能通过抑制p38途径的激活而促使MSCs分化为脂肪细胞；而抑制ERK途径后则无此作用。