论文部分内容阅读
目的： 1. ω-3多不饱和脂肪酸（ω-3 polyunsaturated fatty acids，ω-3 PUFAs）的主要成分为二十二碳六烯酸（ docosahexaenoic acid ， DHA ）和二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acids，EPA）。ω-3 PUFAs对多种恶性肿瘤均具有抑制作用，且能增强化疗药物的疗效，改善耐药性，但具体的作用机制尚不明确。通过体外细胞实验研究DHA联合化疗药物5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）对胃癌细胞的增殖、凋亡和迁移的作用，并对作用机制进行初步探讨。 2. 通过体内动物实验研究ω-3 PUFAs脂肪乳剂联合5-FU对胃癌荷瘤鼠和皮下移植瘤的作用，并初步探讨ω-3 PUFAs对胃癌生长、凋亡及侵袭转移的相关作用机制。 3. 结合体外、体内实验结果分析ω-3 PUFAs对胃癌细胞和肿瘤组织的作用，从而为胃癌的临床治疗提供一个新的思路。 方法： 1. DHA联合5-FU对胃癌SGC7901细胞增殖、凋亡和迁移作用及其机制的体外研究。实验分为对照组、DHA组、5-FU组和DHA联合5-FU组，CCK8法分别检测不同浓度的DHA和5-FU及两药联合作用24h、48h和72h对细胞增殖的影响；流式细胞术分别检测药物作用48h对细胞周期、细胞凋亡的影响；划痕实验及Transwell实验检测药物对细胞迁移的影响；免疫荧光实验检测药物作用48h对细胞微丝、微管结构的影响；荧光定量PCR分别检测药物作用48h对RhoA、RhoC和ROCK1 mRNA水平的影响；Western blot分别检测药物对RhoA、RhoC和ROCK1蛋白质及凋亡相关蛋白质水平的影响。 2. ω-3 PUFAs脂肪乳剂联合5-FU对胃癌荷瘤鼠移植瘤生长作用及其机制的体内研究。以BALB/C系裸鼠构建胃癌移植瘤模型，将模型鼠分为对照组、ω-3 PUFAs组、5-FU组和联合用药组，观察记录裸鼠一般情况和移植瘤生长情况；HE染色观察肿瘤组织形态学变化；荧光定量PCR检测肿瘤组织RhoA、RhoC及ROCK1 mRNA水平；免疫荧光实验检测RhoA、RhoC及ROCK1蛋白质的表达情况；Western blot分别检测组织中RhoA、RhoC和ROCK1蛋白质及凋亡相关蛋白质水平；TUNEL染色实验检测肿瘤细胞的凋亡情况。 结果： 1. 细胞体外实验中，低浓度DHA单独作用于胃癌细胞时，对细胞的增殖抑制作用不明显，较高浓度时有显著抑制作用，5-FU单独作用于胃癌细胞时，其对胃癌细胞的增殖抑制作用随着时间延长和剂量增加而逐渐增强。40μg/mL DHA与4μg/mL 5-FU联合应用时有明显的增效作用（P＜0.05）。 2. DHA、5-FU单独及联合作用于胃癌细胞时，主要使G0/G1期细胞增多，G2/M期和S期细胞减少，将细胞周期阻滞在G0/G1期。 3. 40μg/mL DHA单独作用时，对细胞凋亡的作用不明显，4μg/mL 5-FU单独及联合作用时可促进细胞的凋亡，引起细胞胞核固缩，核染色质发生聚集。4μg/mL 5-FU组和联合组可明显降低细胞Bcl-2蛋白的表达水平，并促进Cleaved Parp蛋白的表达。 4. 40μg/mL DHA与4μg/mL 5-FU单独及联合作用均使细胞迁移率下降，并引起细胞微丝、微管数目减少，结构和排列紊乱。 5. 40μg/mL DHA组及4μg/mL 5-FU 组RhoA mRNA水平下降，而RhoC mRNA水平在5-FU组及联合组均有升高。与对照组相比，各用药组RhoA蛋白质水平均有下降，5-FU组及联合组ROCK1蛋白质水平下降，RhoC蛋白无明显变化（P＞0.05）。 6. 裸鼠皮下移植瘤实验，ω-3 PUFAs单药组对裸鼠移植瘤的生长无明显抑制作用（P＞0.05），与5-FU联合作用可降低移植瘤的体积和重量。ω-3 PUFAs、5-FU单独及联合作用可导致移植瘤血管生成减少，组织坏死区域增多。 7. ω-3 PUFAs联合5-FU可降低移植瘤组织RhoA mRNA水平，对RhoC和ROCK1基因mRNA水平作用不明显。ω-3 PUFAs、5-FU单独及联合作用均使RhoA蛋白质水平下降，5-FU单药组及联合组可使ROCK1蛋白质水平降低，而对RhoC蛋白质的表达水平无明显作用。 8. ω-3 PUFAs、5-FU单药组及联合组均能增加移植瘤组织凋亡细胞的数量，5-FU单药组及联合组降低了Bcl-2和Caspase-9蛋白质的表达水平，并增加了Cleaved Parp蛋白质的表达量。 结论： 1. DHA 在较高浓度时能抑制胃癌细胞的增殖，联合 5-FU 可增强对胃癌SGC7901细胞的增殖抑制作用，协同发挥抑癌效果。 2. DHA联合5-FU显著抑制胃癌细胞的迁移，可能与影响细胞骨架结构的变化有关。 3. ω-3 PUFAs鱼油乳剂单用对裸鼠移植瘤生长的作用不明显，联合5-FU可抑制移植瘤的生长。 4. ω-3 PUFAs鱼油乳剂联合5-FU可减少移植瘤新生血管的生成数量，可能与抑制肿瘤组织的侵袭转移性相关。 5. ω-3 PUFAs联合5-FU可能通过下调Bcl-2蛋白质的表达水平来促进细胞的凋亡，并通过抑制RhoA、ROCK1蛋白质的表达水平，从而最终影响胃癌的增殖、转移。